何志軍　白楊　趙瓊暉　歐陽霈　倪嘉纘　劉瓊　甘文標(biāo)　張學(xué)記

摘?要?阿爾茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是老年人中的主要癡呆類型。目前臨床用藥物只能緩解癥狀、無治療效果， 因此， 亟需開發(fā)有效的AD治療藥物。本研究以三轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠3×Tg?AD為研究對象， 對2月齡AD小鼠分別給予0.2和1.0 mmol/L乙基麥芽酚氧釩（BEOV）飲用水2個月， 采用曠場實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮、Y迷宮3種行為學(xué)測試法， 發(fā)現(xiàn)BEOV可以顯著改善4月齡AD小鼠的自發(fā)活動、探索和記憶能力、減輕小鼠的焦慮狀態(tài)。采用活體熒光成像技術(shù)在體追蹤檢測2.5和3.5月齡小鼠腦皮層神經(jīng)元樹突棘的變化， 發(fā)現(xiàn)YFP熒光小鼠樹突棘數(shù)量呈增多趨勢; 而3×Tg?AD與YFP小鼠雜交后代AD?YFP小鼠的樹突棘則呈下降趨勢。與AD?YFP鼠相比較， 補(bǔ)充1.0 mmol/L BEOV的AD?YFP小鼠， 腦皮層神經(jīng)元總樹突棘、蘑菇型樹突棘、細(xì)小型樹突棘數(shù)量均呈顯著增加， 說明BEOV可保護(hù)神經(jīng)元、減少小鼠樹突棘的丟失。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP?MS）檢測3×Tg?AD鼠腦金屬離子水平， 結(jié)果表明， 1.0 mmol/L BEOV能顯著提高鼠腦V和Se的水平、降低Fe、Zn、Hg、Pb、Bi和Ni的水平， 說明V可與Se協(xié)同調(diào)控AD鼠腦中多種金屬離子水平。本研究表明， BEOV可通過調(diào)控AD鼠腦中多種金屬離子的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡， 保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞， 抑制AD小鼠神經(jīng)元樹突棘丟失， 從而增強(qiáng)小鼠記憶能力， 干預(yù)AD病理進(jìn)程。

關(guān)鍵詞?阿爾茨海默病; 乙基麥芽酚氧釩; 活體熒光成像; 樹突棘; 電感耦合?等離子體質(zhì)譜

1?引 言

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease， AD）是一種神經(jīng)退行性疾病。臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能障礙， 日常生活能力進(jìn)行性減退， 并伴隨有精神疾病癥狀和行為障礙。AD有三大病理特征： 腦部海馬和皮層區(qū)β淀粉樣蛋白（β?amyloid protein， Aβ）在細(xì)胞外聚集形成老年斑（SP）、神經(jīng)元中過度磷酸化的Tau蛋白異常聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)（NFT）、神經(jīng)元突觸功能異常及錐體神經(jīng)元丟失[1]。根據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織指南“降低認(rèn)知衰退與癡呆風(fēng)險(xiǎn)”中的數(shù)據(jù)[2]， 全球癡呆患者約5千萬， 每年新增癡呆病例近1千萬， AD是癡呆病中最常見的一種類型[3～5]。 預(yù)計(jì)到2050年中國60歲以上老人將達(dá)4.38億。目前臨床使用的抗AD藥物只能用于緩解癥狀， 不能逆轉(zhuǎn)或阻止AD病程， 因此， 亟需研發(fā)有效的AD治療藥物。

AD患者腦內(nèi)存在胰島素抵抗。II型糖尿?。═2DM）患者罹患AD的風(fēng)險(xiǎn)明顯高于非糖尿病人[6]。AD和T2DM在信號傳導(dǎo)上游具有交叉點(diǎn)與共同通路， 提示糖尿病治療藥物有可能改善AD的病理變化。釩化合物對糖尿病的作用效果和機(jī)制已有大量報(bào)道[7～10]， 但它們對AD作用的報(bào)道甚少。目前， 已發(fā)現(xiàn)乙酰丙酮氧釩能通過調(diào)控過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）信號通路抑制AD模型小鼠腦中Aβ的生成， 改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力， 并通過調(diào)控糖原合成酶激酶?3β（GSK?3β）信號通路減少SH?SY5Y細(xì)胞中tau蛋白的過度磷酸化[11，12]。釩酸鈉可激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B （PI3K/PKB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等激酶， 降低大鼠海馬tau蛋白的磷酸化[13]。有關(guān)釩化合物對AD腦中金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)的調(diào)控及神經(jīng)元樹突棘生長發(fā)育的影響， 尚未見報(bào)道。

乙基麥芽酚氧釩（Bis（ethylmaltolato）oxovanadium， BEOV）具有良好的水溶性及愉悅的麥芽香氣， 其干預(yù)糖尿病和癌癥的作用和機(jī)制已有報(bào)道。BEOV具有類胰島素作用， 能夠促進(jìn)葡萄糖攝取和抑制脂肪分解。與其它釩化合物相比， BEOV具有良好的小腸上皮細(xì)胞吸收性和低毒性[14]， 在降血糖方面具有良好的效果[15，16]。BEOV可通過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)， 并與胰島素受體或類胰島素受體結(jié)合。因此推測它可能對AD也有治療作用。

金屬離子為機(jī)體維持正常生理功能所必需物質(zhì)。 然而， AD患者腦內(nèi)通常會出現(xiàn)金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡， 例如出現(xiàn)Fe3+、Cu2+和Zn2+的大量積累， 以及氧化還原活性金屬離子的失調(diào)， 誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧（ROS）， 導(dǎo)致神經(jīng)元損傷[17～21]。因此， 針對金屬離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡進(jìn)行AD病理進(jìn)程的干預(yù)， 有望成為一種潛在的AD治療方法[22 ～ 24]。

樹突棘是神經(jīng)元樹突分枝上的棘狀突起，是神經(jīng)元間形成突觸的主要部位。在學(xué)習(xí)記憶過程中，突觸可塑性常與樹突棘的形成、脫落、擴(kuò)張和萎縮等形態(tài)變化相伴發(fā)生。本研究采用正置激光共聚焦顯微鏡對三轉(zhuǎn)基因AD熒光小鼠（AD?YFP）腦皮層神經(jīng)元樹突棘的變化進(jìn)行活體追蹤成像， 在體研究BEOV對神經(jīng)元生長發(fā)育的作用。同時， 采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP?MS）檢測AD小鼠腦組織中金屬離子的變化， 探索BEOV干預(yù)AD病理過程的機(jī)制。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

正置熒光顯微鏡、FV?1000雙光子激光掃描顯微鏡（日本Olympus公司）; 解剖顯微鏡（德國Leica公司）; 微型牙科鉆（德國Fine Science Tools公司）; 曠場實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（深圳瑞沃德生命科技有限公司）; 十字高架迷宮系統(tǒng)（深圳瑞沃德生命科技有限公司）; R500通用型小動物麻醉機(jī)（深圳瑞沃德生命科技有限公司）; 高壓微波消解儀（美國CEM公司）; 7700A電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）。

BEOV（純度>99%， 武漢貝爾卡生物醫(yī)藥公司）; 戊巴比妥鈉（美國Sigma公司）; 電子級純度HNO3（阿拉丁試劑有限公司）; 異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司）; 義齒基托樹脂自凝牙托水（上海新世紀(jì)齒科材料有限公司）; 人工腦脊液（南京億迅生物科技有限公司）。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?動物飼養(yǎng)與給藥?三轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠（品系： B6;129?Psen1tm1MpmTg（APPSwe，tauP301L）1Lfa/J; 縮寫： 3×Tg?AD; 編號： 004807）購于美國Jackson動物實(shí)驗(yàn)室， 能在腦內(nèi)過表達(dá)人源突變基因APPswe、tauP301L以及鼠源PS1M146V突變基因。將24只2月齡AD小鼠隨機(jī)分成3組， 分別為AD組、飲用含低濃度或高濃度BEOV水的AD給藥組， 每組8只小鼠。同時選取8只同月齡的野生型小鼠（品系： B6： 129SF2/J）作為正常對照組（WT組）。給藥組小鼠分別飲用濃度為0.2和1.0 mmol/L的EBOV溶液， 其它組小鼠飲用超純水， 給藥2個月后處死。

轉(zhuǎn)基因熒光小鼠（品系： B6.Cg?Tg（Thy1?YFP）HJrs/J; 名稱： thy1?YFP?H; 縮寫： YFP）由甘文標(biāo)教授實(shí)驗(yàn)室提供。AD小鼠與YFP小鼠雜交篩選獲得2.5月齡雄性AD?YFP小鼠9只， 隨機(jī)分為3組， 每組3只， 其中2組分別給予含0.2和1.0 mmol/L BEOV的飲用水， 作為給藥組， 給藥1個月。另一組AD?YFP小鼠給予超純水， 作為AD對照組。再選取3只同月齡同性別的YFP小鼠作為正常對照組， 飲用超純水。所有小鼠都在溫度為22℃±1℃、相對濕度為60%±5%、光照節(jié)律為12L∶12D（7：00～19：00）條件下的動物房中飼養(yǎng)， 小鼠都能夠自由攝取飲用水和食物。

2.2.2?小鼠行為學(xué)檢測??（1）曠場實(shí)驗(yàn)（OFT）?用于評價(jià)動物在新異環(huán)境中自主探索能力和緊張程度。曠場實(shí)驗(yàn)箱100 cm×100 cm×30 cm， 底部平均分成16個25 cm×25 cm的正方形小格， 正上方2 m處架有一個活動記錄儀， 背景噪音保持在65 dB以下。將小鼠放入試驗(yàn)箱中央， 開始記錄， 讓小鼠自由探索5 min， 詳細(xì)實(shí)驗(yàn)步驟見文獻(xiàn)[25]。實(shí)驗(yàn)測試指標(biāo)： 小鼠穿過格子數(shù)（Cross grid）、后肢站立次數(shù)（Rearing）、尿便次數(shù)（Defecation）等。（2）高架十字迷宮（EPM）?用于評價(jià)小鼠的焦慮狀態(tài)。由2個封閉臂（35 cm×5 cm×10 cm）、2個開放臂（35 cm×5 cm）， 一個連接4個臂的中央平臺等組成。測試前， 先將小鼠放置在一個盒中讓其自由探索5 min， 然后迅速將小鼠置于十字迷宮的中央平臺上測試5 min， 詳細(xì)操作步驟見文獻(xiàn)[26]。實(shí)驗(yàn)測試的指標(biāo)包括： 小鼠進(jìn)入開放臂的次數(shù)（OE）、時間（OT）， 小鼠進(jìn)入封閉臂的次數(shù)（CE）、時間（CT）; 小鼠進(jìn)入封閉臂和開放臂的總次數(shù)（OE+CE）; 小鼠進(jìn)入開放臂次數(shù)比例（POE， %）=OE/（OE+CE）×100%; 小鼠進(jìn)入開放臂時間比例（POT， %）=OT/（OT+CT）×100%。（3） Y迷宮?用于評價(jià)小鼠的記憶能力。由3個等長的臂（40 cm×3 cm×12 cm）組成， 每個臂之間夾角為120°。測試時， 將小鼠置于其中一個臂的末端， 讓其在Y迷宮中自由探索8 min， 記錄并分析小鼠進(jìn)入迷宮各臂的順序、時間及次數(shù)。小鼠在迷宮臂中的轉(zhuǎn)移順序（如ABC， ?BAC， CBA而不算ABA）作為一次交替， 從而反映了小鼠的辨別及記憶能力。詳細(xì)操作步驟見文獻(xiàn)[27]。實(shí)驗(yàn)測試指標(biāo)： 小鼠進(jìn)臂的交替次數(shù)和進(jìn)臂總次數(shù)。計(jì)算小鼠的交替率， 交替率=[交替次數(shù)/（進(jìn)臂總次數(shù)-2）]×100%。

2.2.3?腦皮層神經(jīng)元樹突棘的活體熒光成像?在熒光成像前， 將2.5月齡的熒光小鼠麻醉， 清理小鼠頭頂目標(biāo)區(qū)域的毛發(fā)， 剪開頭皮， 暴露出顱骨。清理干凈后， 利用立體定位法確定所要觀察及成像的目標(biāo)區(qū)域。先將兩個不銹鋼釘平行固定于特制的金屬板上， 然后利用502膠水將打磨之后的小鼠顱骨粘在不銹鋼釘上， 隨后用牙科水泥對顱骨進(jìn)一步固定， 固定完成后， 在解剖鏡下用微型牙科鉆對顱骨進(jìn)行打薄處理， 直徑約為0.5～1 mm， 顱骨的厚度磨薄至約20 μm。在暴露的小鼠顱骨上滴加人工腦脊液（ACSF）浸潤， 防止打磨完后的腦組織長時間暴露在外面而引起損傷。隨后將小鼠放置于雙光子成像系統(tǒng)下進(jìn)行熒光成像。成像完成后， 待小鼠清醒， 將其放回原籠中繼續(xù)飼養(yǎng)1個月。當(dāng)小鼠到達(dá)3.5月齡后， 按照同樣的方法， 對同一位置重復(fù)成像。實(shí)驗(yàn)測試的指標(biāo)主要包括樹突棘的形態(tài)及數(shù)量。利用ImageJ 和Graphpad Prism7軟件對圖像中神經(jīng)元樹突棘進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2.2.4?金屬離子的電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測?小鼠完成相關(guān)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后， 麻醉處死， 取出大腦， 準(zhǔn)確稱量左半腦的重量， 加入10 mL 10%的電子級純度HNO3， 裝入消解管在微波消解儀中150℃消解120 min。消解完全后定容至20.0 mL。稀釋消化液到適當(dāng)濃度， 采用電感耦合等離子質(zhì)譜儀（ICP?MS）測定各組小鼠腦組織中9種元素（V、Se、Fe、Cu、Zn、Hg、Bi、Pb、Ni）的含量， 同步操作樣品空白及質(zhì)量控制樣品。元素測定過程中所使用的儀器均經(jīng)過國家質(zhì)檢部門檢定和校準(zhǔn)。ICP?MS測定小鼠腦組織樣品時采用外標(biāo)法和國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)人發(fā)（GBw09101a）進(jìn)行質(zhì)量控制。

2.2.5?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0軟件分析處理數(shù)據(jù)， 計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示， 多組間比較采用單因素方差分析（One?way ANOVA）， 組間兩兩比較采用SNK?q檢驗(yàn)， p <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3?結(jié)果與討論

4?結(jié) 論

以三轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠3×Tg?AD為研究對象， 通過曠場實(shí)驗(yàn)＼， 十字迷宮和丫迷宮3種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測， 發(fā)現(xiàn)BEOV可以顯著改善4月齡AD小鼠的自發(fā)活動和探索記憶能力， 減輕小鼠的焦慮狀態(tài)。通過在體觀測小鼠腦神經(jīng)元樹突棘的變化， 發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充BEOV能抑制AD?YFP小鼠腦神經(jīng)元樹突棘的減少， 顯著增加總樹突棘、蘑菇型樹突棘、細(xì)小型樹突棘的數(shù)量。通過檢測小鼠腦組織中金屬離子含量的變化， 發(fā)現(xiàn)BEOV能顯著提高AD小鼠腦組織中V和Se含量水平、降低Fe、Zn、Hg、Pb、Bi、Ni含量水平。研究結(jié)果表明， BEOV能通過調(diào)控AD鼠腦中金屬離子的內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡， 保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞， 抑制AD小鼠神經(jīng)元樹突棘丟失， 從而干預(yù)AD病理進(jìn)程。

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Application of in Vivo Fluorescence Imaging and Metal Ion

Detection for Investigation of Bis（ethylmaltolato）

Oxidovanadiumon Alzheimer's Disease

HE Zhi?Jun1， BAI Yang2， ZHAO Qiong?Hui4， OUYANG Pei1， NI Jia?Zuan1，

LIU Qiong*1， GAN Wen?Biao*2， ZHANG Xue?Ji*3

1（College of Life Sciences & Oceanography， Shenzhen University， Shenzhen 518055， China）

2（Key Laboratory of Chemical Genomics， Peking University Shenzhen Graduate School， Shenzhen 518055， China）

3（College of Biomedical Engineering， Health Science Center， Shenzhen University， Shenzhen 518055， China）

4（Shenzhen Food Inspection Center of CIQ， Shenzhen 518042， China）

Abstract?Alzheimer's disease （AD） is a major type of dementia in the elderly. Clinical medication at present can only relieve symptoms but has no therapeutical effect. Thus， it is urgent to develop an effective drug for the treatment of AD. In this study， 2?month?old triple transgenic AD model mice （3×Tg?AD） were treated respectively with 0.2 and 1.0 mmol/L bis（ethylmaltolato） oxidovanadium IV （BEOV） in drinking water for 2 months. The open field test， the elevated plus?maze test and the Y maze test were applied to those mice， showing that BEOV could significantly improve the exploratory ability， memory capacity and exercise ability and relieve the anxiety of 4?month?old 3×Tg?AD mice. The dendritic spines of pyramidal neurons in neocortex were detected by in?vivo two?photon imaging of YFP and AD?YFP mice （the offspring of 3×Tg?AD and YFP mice）. The numbers of dendritic spines increased in YFP mice but decreased in AD?YFP mice from 2.5?month?old to 3.5?month?old. Treatment with 1.0 mmol/L BEOV in the AD?YFP mice significantly increased the numbers of total dendritic spines， mushroom spines and thin spines， which suggested that BEOV could protect cortical neurons and reduce the loss of dendritic spines. The levels of metal ions in the brain of mice were further measured by inductively coupled plasma mass spectrometry （ICP?MS）. The results showed that 1.0 mmol/L BEOV could significantly increase the levels of V and Se and decrease the levels of Fe， Zn， Hg， Pb， Bi and Ni in AD brains， implying that vanadium might synergize with selenium to regulate the levels of metal ions in AD mice. Summarily， BEOV could mediate the homeostasis of multiple metal ions in AD brain and protect cortical neurons and thus to interfere with the pathological process of AD.

Keywords?Alzheimer's disease; Bis（ethylmaltolato） oxidovanadium IV; In?vivo fluorescence imaging; Dendritic spines; Inductively coupled plasma mass spectrometry