都展宏　魯藝　王立平

摘?要?神經遞質的在體檢測不僅可能作為帕金森氏癥、阿爾茲海默癥、抑郁癥等多種神經疾病的生物標記物，同時，這類傳感器也可作為研究獎賞、成癮、厭惡等多種行為產生機制的重要工具。近年來，多種檢測神經遞質的分析技術已得到了長足的發(fā)展，但目前應用于疾病研究和在體檢測的傳感技術與材料尚面臨一些困難，只有較少的應用實例。本文主要介紹了癲癇、帕金森氏癥、腦卒中、阿爾茲海默癥、精神分裂等疾病中神經遞質發(fā)揮的重要作用及其檢測的科學意義，探討了在體傳感器技術的進展，以及可能用于解析疾病神經環(huán)路機制的相關技術和器件，重點探討了多種納米材料、導電聚合物材料和生物分子作為在體傳感器組成成分的應用技術，以及未來這些新技術、新材料面臨的機遇與挑戰(zhàn)。

關鍵詞?神經遞質; 生物傳感器; 納米材料; 成像技術; 疾病診斷; 評述

1?引 言

神經遞質是體內負責在神經元與其它細胞類型間傳遞或調控特定信號的化學分子。常見的神經遞質分子包括谷氨酸、γ?氨基丁酸、多巴胺、乙酰膽堿、腎上腺素、血清素、去甲腎上腺素和一氧化氮等[1]。神經遞質分子在行為與認知發(fā)生等腦功能中都發(fā)揮著重要作用; 同時，它們在調控心率、學習記憶、睡眠、覺醒、意識、情緒和食欲等方面具有重要意義。以谷氨酸為例，它是大腦最重要的興奮性神經遞質，在學習記憶、大腦發(fā)育、情緒情感調節(jié)等過程中都發(fā)揮了重要作用。谷氨酸能神經元的異常也與多種疾病相關，如神經退行性疾病和精神類疾病等[2]。本文重點介紹了一些重要神經遞質分子在多種神經系統(tǒng)疾病中的作用機制，如圖1所示[3～9]。本文還介紹了神經遞質檢測技術和器件、目前用于神經系統(tǒng)疾病相關的環(huán)路研究機制、為滿足疾病診療需求開發(fā)的相關技術，以及為遞質傳感器界面開發(fā)的多種類別的電極材料。最后，簡要介紹了這些遞質傳感技術在疾病與神經科學應用中面臨的機遇與挑戰(zhàn)。

2?神經遞質在腦功能與神經疾病中的作用

各種神經遞質分子在神經系統(tǒng)的活動中各自發(fā)揮著不同的作用，并且很多神經疾病都以一種或數(shù)種神經遞質系統(tǒng)的突觸傳遞發(fā)生改變?yōu)樘卣?。神經遞質檢測技術既可幫助研究者更好地理解這種遞質在生理和病理方面的作用，又可有效地驗證針對特定神經遞質系統(tǒng)的治療方法與某些特定的療效或行為改變的相關性。 以下對5種高發(fā)的神經疾病及其密切相關的神經遞質系統(tǒng)功能異常做簡要介紹，這些病理神經遞質系統(tǒng)有可能成為神經遞質傳感器重要的在體應用研究方向。

2.1?癲癇

大腦中最普遍的興奮性神經遞質谷氨酸和最普遍的抑制性神經遞質γ?氨基丁酸在多數(shù)腦區(qū)和核團中都普遍存在，也介導了多數(shù)長程神經投射的功能，而谷氨酸與γ?氨基丁酸對神經功能的作用最直接、最顯著，其中研究最多的疾病就是癲癇。在患者大腦中，一些細胞集群活動的增強和同步可能導致癲癇發(fā)作，并且，有些細胞亞群可能會產生內源性的爆發(fā)性發(fā)放狀態(tài)，這些機制的產生可能與γ?氨基丁酸、谷氨酸作用機制密切相關，特別是NMDA受體介導的興奮性谷氨酸電流[10，11]。這些興奮性和抑制性神經遞質系統(tǒng)在癲癇疾病發(fā)作中的異常，特別是其與癲癇起始、持續(xù)放電和傳播之間的關系已有大量的經典研究支持[12～14]。然而，這種過度的興奮性發(fā)放究竟是由于γ?氨基丁酸能神經元死亡而導致的抑制性活動減弱，還是由于γ?氨基丁酸本身釋放減少或者受體減少導致突觸傳遞功能減弱，目前仍然不清楚。

在腦內直接給予谷氨酸或者其受體激動劑（如N?甲基?D?天冬氨酸（N?methyl?D?aspartate，NMDA））即可直接誘發(fā)癲癇。并且，大多數(shù)神經元的谷氨酸濃度可達到10 mmol/L，遠高于其它興奮性遞質的濃度。一旦神經細胞受損，胞內谷氨酸就會泄漏出來，而胞外普遍存在谷氨酸受體。另外，一旦神經組織的結構產生病變，如腦中的瘢痕組織、腫瘤的發(fā)生和生長，以及其它產生膠質細胞病變的情況，都很可能損傷胞外的高效率谷氨酸轉運重吸收系統(tǒng)[15]，這些系統(tǒng)能穩(wěn)定地將胞外的谷氨酸濃度維持在5 mmol/L以下，最多不超過10 mmol/L。

相關研究表明，在癲癇灶點位置γ?氨基丁酸可使神經元或神經末梢有一定的損傷[16，17]，但也有人體組織研究表明，患者海馬體內γ?氨基丁酸神經元的群體未見變化[18]。動物模型中，點燃癲癇模型的大鼠杏仁核內γ?氨基丁酸能神經元或神經末梢顯著下降（約30%～50%），杏仁核內γ?氨基丁酸的濃度也觀測到類似比例的下降[19，20]。作為顳葉癲癇密切相關的腦區(qū)，海馬與杏仁核的遞質系統(tǒng)病變對于癲癇研究有重要的指示作用。有研究表明，在人體顳葉癲癇灶點位置手術切除的組織中，用神經化學檢測的方式可測得γ?氨基丁酸能突觸傳遞明顯下降[21，22]，然而現(xiàn)有研究未能證實該結果[18]。有研究證明，點燃癲癇模型大鼠的杏仁核胞外微透析實驗測得的γ?氨基丁酸濃度顯著下降了60%～70% [23]，一定程度上反映了癲癇動物中樞神經系統(tǒng)中γ?氨基丁酸的合成明顯降低。針對興奮/抑制遞質系統(tǒng)失衡的特點，長期的經驗和研究表明，采用可影響胞外γ?氨基丁酸代謝的藥物增加中樞神經系統(tǒng)中的γ?氨基丁酸濃度， 可作為抑制癲癇的手段，但通過谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase， GAD）抑制劑降低γ?氨基丁酸濃度， 則會導致癲癇發(fā)生。

2.2?帕金森氏癥

帕金森氏癥的病理特征中，最顯著的標志是在所有向端腦腦區(qū)投射的多巴胺能神經元突觸前化學遞質的減少[24～26]。這種多巴胺能投射減弱的最主要原因是黑質及其相關的黑質旁核中的多巴胺能神經元胞體減少。研究表明，密集投射到紋狀體、伏隔核、嗅覺腦區(qū)和邊緣皮層區(qū)域的多巴胺能神經纖維主要源自黑質的致密區(qū)[27，28]。一旦以藥物抑制或物理損傷等方式破壞黑質投射到基底神經節(jié)的多巴胺能神經元，基底神經節(jié)的正常功能就會受到嚴重影響。無論在動物模型， 還是人體中，這種紋狀體中多巴胺能投射的減少都介導了帕金森氏癥中的主要癥狀（運動遲緩、肌強直、靜止性震顫）。在帕金森氏癥患者腦內的黑質、尾狀核、殼核、蒼白球等腦區(qū)中，無論是多巴胺濃度， 還是其代謝產物（高香草酸）的濃度，都明顯減少[29～31]。在原發(fā)性帕金森氏癥中，整體多巴胺損傷程度略輕，并且殼核受損比尾狀核嚴重[29]; 而在腦炎性帕金森病癥中，多巴胺能投射均有相對均勻的嚴重損傷。這種差異的主要原因為腦炎型帕金森氏癥中，黑質多巴胺神經元受到普遍的嚴重損傷，而原發(fā)性帕金森氏癥中的黑質多巴胺神經元損傷相對較輕，且主要影響特定區(qū)域的多巴胺能神經元胞體，如尾側黑質中的多巴胺能神經元[29]，而這些神經元主要投射到殼核中。因此，在多巴胺能投射豐富的腦區(qū)測定多巴胺濃度的空間分布對研究各種癥狀的環(huán)路機制和開發(fā)針對性診療工具都具有重要的作用。

2.3?腦卒中

腦卒中是另一大類發(fā)作率非常高的神經系統(tǒng)疾病，谷氨酸興奮性毒性導致的皮層損傷是卒中最嚴重的后果之一[32]。 盡管卒中方面的基礎研究已取得了很多進展，臨床上針對這種嚴重病情所做的各種治療和預防嘗試都還未能達到很好的效果。在腦缺血發(fā)生后，神經元釋放的大量谷氨酸會激活多種突觸前和突觸后的谷氨酸受體，從而導致胞內Ca2+濃度上升，進而導致氧自由基產生，線粒體功能異常，蛋白酶、磷酸酯酶、限制性內切酶等多種酶的激活，從而造成細胞死亡。同時，腦缺血發(fā)生后，興奮性氨基酸轉運體（Excitatory amino acid transporter 1，EAAT1）和EAAT2均有明顯損失，造成了胞外谷氨酸濃度升高，最終導致神經元死亡[33～35]。另一種重要的細胞星形膠質細胞對長時間的乳酸中毒非常敏感[36]，直接導致它們在酸性環(huán)境無法維持三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate，ATP）產生[37]。ATP濃度下降進一步導致星形膠質細胞的跨膜離子濃度梯度無法維持，鈉鉀離子ATP酶的活性被抑制，進而導致Na+內流，胞內Na+濃度升高，星形膠質細胞胞內的谷氨酸由于其轉運受到Na+濃度的影響而被轉移到胞外[38]，相當于谷氨酸轉運體的功能被逆轉[39?41]。這一過程與神經細胞的谷氨酸系統(tǒng)異常聯(lián)合將導致胞外谷氨酸濃度進一步升高。因此，在相對溫和的腦缺血狀態(tài)下，星形膠質細胞通過谷氨酸轉運體將一些谷氨酸轉移到胞內，實現(xiàn)神經保護，但在嚴重缺血狀態(tài)下， 星形膠質細胞會起反作用，進一步加劇毒性[42]。在腦缺血的過程中，大腦白質中的細胞會受到嚴重影響，少突膠質細胞和它們產生的髓鞘會受到興奮性毒性的嚴重影響[43～47]，而白質中的軸突則會由于胞內Ca2+濃度劇烈升高導致的毒性而嚴重受損[48～50]。

2.4?阿爾茲海默癥

關于阿爾茲海默癥的理論已有多方面的研究，其中一種與神經遞質系統(tǒng)功能異常密切相關的神經毒性理論認為，當局部谷氨酸濃度過高時，會對腦組織產生毒性[51]。一種假說認為，谷氨酸興奮性毒性會激活代謝型谷氨酸受體及下游的一系列分子通路，導致阿爾茲海默癥的發(fā)生。同時，這些通路也被認為是可能的藥物治療靶點，因此，針對代謝型谷氨酸受體的調控通路，研究者也在開發(fā)多種阿爾茲海默癥的潛在治療藥物[52]。這些受體下游有大量復雜的G蛋白偶聯(lián)受體相關通路，因此可能的調控干預方式也存在各種差別。另一種對阿爾茲海默癥十分重要的神經遞質分子乙酰膽堿不僅在大腦中發(fā)揮重要的作用，也在脊髓和其它組織中調控多種重要功能。 分泌乙酰膽堿的神經元被稱為膽堿能受體， 而乙酰膽堿在認知和運動等多個功能的執(zhí)行中都有不可替代的作用。近年，針對谷氨酸和乙酰膽堿等遞質開發(fā)了一系列基于酶反應的體內及體外生物傳感器系統(tǒng)[53]。而主流的研究認為，腦內乙酰膽堿含量增多與阿爾茲海默癥的癥狀改善密切相關，因而多種乙酰膽堿和谷氨酸傳感器均有可能在阿爾茲海默癥相關研究中發(fā)揮重要作用。

2.5?精神分裂癥

一種重要的精神分裂癥成因假說是谷氨酸能神經元的功能弱化導致該病發(fā)生[54]。在患者腦脊液中測得的谷氨酸濃度降低及谷氨酸拮抗劑可導致部分癥狀產生的現(xiàn)象均可在一定程度證明該假說。特別是鹽酸苯環(huán)己哌啶的使用可誘導一種類似于精神分裂癥的疾病狀態(tài)， 使得該假說被相對廣泛地接受[55，56]。另一方面，苯環(huán)己哌啶及類似物（如鹽酸氯胺酮和地卓西平馬來酸鹽）均可通過結合谷氨酸的NMDA受體而非競爭性抑制該受體作用，從而誘導精神分裂癥的行為學表征[57]。

一些研究也證實了精神分裂癥患者腦中的谷氨酸能系統(tǒng)異常。在精神分裂癥患者大腦皮層組織中， 突觸小體中谷氨酸釋放明顯缺陷，而使用氟哌啶醇預處理這些組織可部分逆轉該作用[58]; 同時，精神分裂癥患者前額葉皮層中，谷氨酸再吸收和海人酸受體的結合均增強[59， 60]，一定程度上反映了患者谷氨酸突觸傳遞活動的降低。相比之下，患者的殼核、海馬體及旁海馬皮質中的海人酸受體結合有一定程度降低[61，62]，在基底神經節(jié)中谷氨酸的重吸收[63]和NMDA受體的表達[64]也有一定程度的降低。這些研究充分證明了谷氨酸傳遞在精神分裂癥患者大腦中發(fā)揮了重要作用，且病理下谷氨酸系統(tǒng)的增強和減弱也有強烈的腦區(qū)特異性。

3?神經遞質檢測的技術和器件

目前， 神經遞質檢測技術的技術和元器件開發(fā)已得到了多方面發(fā)展[51， 65～69]。在檢測遞質的電化學方法中，采用伏安法可測定多種自身具有氧化還原特性的神經遞質，典型的包括多巴胺、去甲腎上腺素、血清素等; 通過酶在電極表面與遞質發(fā)生反應并用電化學方法檢測該過程的酶傳感器也得到了多種應用，包括谷氨酸、乙酰膽堿等遞質的檢測; 而為了在各種生物實驗設定下得到腦組織內遞質濃度分布的空間信息，細胞表達的熒光探針結合成像技術也已可探測多種神經遞質分子; 綜合考慮檢測的時間分辨率、樣品使用量、電極生產的穩(wěn)定性和可重復性等方面的需求，進一步使用微流控器件和場效應管（Field effect transistor，F(xiàn)ET）等器件的開發(fā)也已取得了多方面應用。本節(jié)將就這些方面分別舉例說明神經遞質分子檢測技術和器件的研究展。

3.1?伏安法測定遞質濃度

在多種電化學技術中，快速循環(huán)伏安法（Fast scan cyclic voltammetry， FSCV）被用于神經遞質分子監(jiān)測，也是在體神經遞質濃度監(jiān)測較成熟的技術。這種技術可在單個位點上準確測量一些種類神經遞質分子的濃度變化，并且時空精度高于微透析等測量方式。除FSCV外，差分脈沖伏安法（Differential pulse voltammetry， DPV）和方波伏安法（Square wave voltammetry， SWV）等方法在遞質檢測中也發(fā)揮了重要作用。關于FSCV測定遞質濃度的生物傳感器已有大量研究報道，且多數(shù)FSCV方法采用碳纖維電極[70]。同時，近期還有一些研究基于新材料的循環(huán)伏安法測定神經遞質濃度，如一種免疫傳感器表面采用了多巴胺單克隆抗體修飾的磁性納米顆粒[10]。在磁性納米顆粒的表面附著了碳納米管（Carbon nanotubes， CNTs），將這種復合物顆粒通過磁力吸附在金電極的表面上，可采用循環(huán)伏安法測定多巴胺的濃度，測定范圍可達到780 pmol/L～50 mmol/L，檢測限（Limit of detection， LOD）可達到120 nmol/L。另一項研究中，通過碳纖維電極測定血小板懸浮液分泌的血清素[71]，采用了FSCV方法，可得到較好的時間分辨率和靈敏度，并且可通過循環(huán)伏安法針對性研究血清素的氧化還原特性。近期開發(fā)的一種無線傳輸?shù)膶崟r電化學傳感器也可通過FSCV方法測定血清素的濃度[72]，該研究使用的1000 V/s的N型快速線性掃描電流（+0.2 V到0.1 V，再到+0.2 V）可在背側中縫核的腦片上檢測電刺激誘發(fā)釋放的血清素濃度，這種傳感器可檢測到10 mmol/L的血清素。

除FSCV外，還有多種伏安法可用于生物傳感器。如血清素傳感器利用分子與配體相互作用的檢測方式，采用金電極表面的自組裝巰甲丙脯氨酸和苯硫醇單分子層[73]。血清素分子可被選擇性強吸附在電極表面，從而檢測到陽極溶出電流或觀察到氧化還原探針的電荷轉移電阻升高。此研究中差分脈沖陽極溶出伏安法和電化學阻抗譜檢測血清素的LOD可分別達到28 nmol/L和1.2 nmol/L。

3.2?酶傳感器

如圖2A所示，采用計時電流法的酶傳感器可測定谷氨酸等多種分子的濃度[74]， 但酶的制備且活性易損， 也有研究者以如圖2B中的核酸適配體制備無酶傳感器[75]。 又如在金電極表面修飾谷氨酸氧化酶（Glutamate oxidase，GluOx）、羧基化多壁碳納米管（Carboxylated multi?walled carbon nanotubes， COOH?MWCNTs）、金納米顆粒和殼聚糖的電極。 實驗發(fā)現(xiàn)這種電極可在5～500 mmol/L范圍內測定谷氨酸的濃度，LOD可達到1.6 mmol/L[76]。多種基于膽堿氧化酶、膽堿酯酶的乙酰膽堿生物傳感器也可用于快速測定乙酰膽堿的濃度[77]，這種傳感器常將酶固定在各種膜層材料或固相表面上，采用計時電流法測定乙酰膽堿的濃度。另一種膽堿和乙酰膽堿的酶傳感器采用了碳纖維表面電聚合的聚鄰苯二胺膜層[78]，同時在膜層固定乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶，隨后沉積的是CNT和萘酚膜。這種計時電流法傳感器可檢測膽堿和乙酰膽堿的濃度，LOD可達45 nmol/L。為了提高傳感器的靈敏度，酶傳感器需要達到近似于單分子層的覆蓋條件[79]。降低膜層的厚度可有效地提高酶傳感器的時間精度，因為這種結構可有效地降低檢測對象分子擴散到達酶層的時間。這項研究中，納米薄層石墨烯修飾的碳纖維電極表面以摩爾比1∶10固定了膽堿酯酶和膽堿氧化酶，這樣可達到最佳的酶反應效率。計時電流法可在10 μmol/L～4 mmol/L范圍內線性檢測乙酰膽堿濃度，LOD為10 μmol/L。另一種基于14～70 nm微管結構的乙酰膽堿傳感器，可采用計時電流法測定250 μmol/L～6 mmol/L的乙酰膽堿濃度[80]，其LOD為205 μmol/L。

盡管循環(huán)伏安法已被成功用于各種在體和離體的多巴胺濃度測定，也有研究通過在碳纖維電極表面交聯(lián)固定的酪氨酸酶開發(fā)針對多巴胺檢測的酶傳感器[81]。在反應中，酪氨酸酶可催化多巴胺和o?多巴醌的轉化，從而實現(xiàn)電流法測定多巴胺濃度， 在10 nmol/L～220 mmol/L濃度范圍內線性關系良好，LOD為1 nmol/L。

3.3?在體分子遺傳熒光探針

光學成像神經遞質檢測技術是一種可通過檢測遞質與熒光探針結合發(fā)光強弱變化測定分子濃度的方法[82]，圖2C顯示了一種谷氨酸熒光探針的原理[82]。與微透析、電流記錄、電化學檢測技術相比，這是一種相對無創(chuàng)且高通量的檢測方式。為了通過光學成像方法檢測某種神經遞質分子的動態(tài)變化，這種檢測熒光蛋白需要滿足以下條件：必須直接、特異地與目標分子發(fā)生結合，并導致蛋白構型的改變; 熒光強度必須隨著這種蛋白構型的改變而發(fā)生變化。

目前，已開發(fā)的具有一定代表性的遞質分子熒光探針已可在多種性能方面實現(xiàn)相對較好的遞質濃度檢測，如γ?氨基丁酸熒光探針傳感器。γ?氨基丁酸?Snifit的Kd=100 μmol/L，熒光強度變化（ΔF/F0）可達到0.5，時間常數(shù)Ton=1.5 s，Toff=2.8 s[83]; 谷氨酸熒光探針傳感器iGluSnFR的Kd=4.9 μmol/L， 熒光強度變化可達到1.03，時間常數(shù)為92 ms[8]; 多巴胺熒光探針傳感器D2?CNiFER的Kd=2.5 nmol/L， 熒光強度變化可達到0.57，時間常數(shù)小于7 s[84]; 乙酰膽堿熒光探針傳感器GACh的Kd=0.78 μmol/L，熒光強度變化可達到0.9，時間常數(shù)為280 ms[85]; 去甲腎上腺素熒光探針傳感器a2AAR?cam的Kd=17 nmol/L，熒光強度變化可達到

0.05，時間常數(shù)為40 ms[86]。

總之，盡管很多種神經遞質熒光探針仍然在信噪比和時間精度方面仍有一定局限性，但這些可通過遺傳操作表達的神經遞質傳感器可提供較好的分子選擇性、空間精度和細胞特異性，而對于在體研究，這些屬性均具有重要作用。

3.4?微流控器件

微流控器件在充分發(fā)揮電極材料優(yōu)勢并可重復生產等方面具有獨特的優(yōu)勢，因此在近年受到越來越多的重視。NO在調控突觸傳遞方面發(fā)揮著重要作用，通過在金/氧化銦錫電極表面沉積一層催化NO轉化成N2的鐵氰化物鍍層作為工作電極而構建的微流控裝置，可用于測定NO的濃度，進一步通過透氣膜層增加傳感器對NO的選擇性，這種傳感器對NO的LOD可達到1 nmol/L[87]。在中樞神經系統(tǒng)中抗壞血酸可有效地對抗谷氨酸誘導的神經毒性作用，并且星型膠質細胞可通過抗壞血酸和谷氨酸分子的胞內外跨膜交換而實現(xiàn)降低胞外谷氨酸濃度[88，89]。針對在體抗壞血酸濃度的檢測，一種單通道的微流控期間可達到很好的檢測效果[90]。這種方法采用了氧化銦錫玻璃上修飾CNT的方式制備工作電極，從而促進抗壞血酸在電極表面的氧化。通過這種技術觀察到，在腦缺血的過程中， 抗壞血酸濃度的逐漸降低; 而在腦缺血再灌注過程中， 抗壞血酸濃度明顯升高。另外，由于Mg2+可通過阻斷鈣通道的方式對NMDA受體發(fā)揮重要的調控作用[91～93]，針對抗壞血酸和Mg2+實現(xiàn)同步檢測的新型微流控器件技術可能在谷氨酸能傳導的研究中發(fā)揮起到重要作用。

通過光蝕刻技術制備的微流控芯片通常具有靈敏度高、快速響應、檢測限低且線性檢測范圍較好的優(yōu)勢， 可應用于生物傳感器[73]。如一種基于計時電流法的雙電極微流控芯片， 采用在芯片上固定乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶的方式檢測乙酰膽堿的濃度， 在優(yōu)化的基底材料上分別固定這兩種酶， 制成的傳感器可提供更寬的動態(tài)區(qū)間，更低的檢測限及優(yōu)良的穩(wěn)定性和可重復性，因此可提高乙酰膽堿傳感器的檢測效率[94]。

3.5?場效應管傳感器

由于神經遞質的釋放通常發(fā)生在毫秒量級，基于場效應管的快速生物傳感器可在研究中起到獨特的重要作用，因而這些場效應管傳感器在生物傳感器領域也逐漸引起關注，如一種SWCNT場效應管傳感器采用了表達m型乙酰膽堿受體的大腸桿菌修飾，這樣可提高乙酰膽堿檢測的靈敏性和選擇性。這種傳感器對乙酰膽堿的LOD可達到100 pmol/L[95]。

另外一項研究中，使用多晶硅線場效應管制成的多巴胺傳感器，可在fmol/L級別檢測多巴胺的濃度，并且這種傳感器的制備可通過現(xiàn)有的商用半導體制造技術實現(xiàn)，因此可能迅速實現(xiàn)穩(wěn)定生產[96]。

4?神經遞質檢測的電極材料

很多種新型電極材料已被用于制作檢測神經遞質的生物傳感器，不同材料在各種遞質的檢測中發(fā)揮各自的獨特作用。其中，金屬納米結構材料可通過模仿酶活性中心的方式， 實現(xiàn)遞質的無酶檢測，而核酸適體材料則可通過測定構像改變后氧化還原電流的變化或電極阻抗變化的方式實現(xiàn)遞質的無酶檢測。這些不依賴電極表面固定酶的生物傳感器材料既可解決酶作為蛋白質可能變性失活的問題，又可大幅度降低傳感器的制作成本，從而方便技術的推廣應用。但體外傳感器技術取得的檢測效果在轉移到體內應用時都面臨多種問題，如電極表面的細胞和蛋白質生物污損更加復雜多樣等。

4.1?碳納米管和石墨烯

采用在電極表面鍍導電膜層的方式可一定程度上改進對多巴胺的檢測性能[97]。例如，帶正電的多巴胺分子和帶負電的卟啉修飾石墨烯電極間可通過分子間芳環(huán)作用和靜電力加速電子轉移，圖3A展示了石墨烯分子的常見結構形態(tài)。相比之下，帶負電的干擾分子（如抗壞血酸和尿酸分子）可被帶負電的卟啉電極表面抑制，這種電極對多巴胺的檢測LOD可達到10 nmol/L。 Prasad等[98]以整合了CNT的聚合材料網(wǎng)絡構成中的腎上腺素分子作為模板分子，在石墨電極表面使用這種復合材料制成分子印跡傳感器電極，采用差分脈沖陽極溶出伏安法（Differential pulse anodic stripping voltammetry， DPASV）測定腎上腺素的濃度，線性范圍在0.5～32 nmol/L之間， LOD可達到10.9 nmol/L。

在血清素檢測方面， 碳納米材料也有多種應用。例如， Sun等[99]采用CNT和離子液體的復合電極材料，可同時檢測血清中的血清素和多巴胺的濃度，血清素的LOD可低至8 nmol/L。然而， 由于多種生物組織液中都普遍存在尿酸， 而尿酸在這種電極上的干擾信號可達到10倍以上，因此限制了其應用。Han等[100]在卟啉修飾的玻碳電極上采用還原的氧化石墨烯材料檢測血清素， LOD可低至4.9 nmol/L。 但由于缺乏實際樣品的測試，尚不確定該電極是否可能用于臨床樣本檢測。由于低阻抗和大的反應面積， 碳納米管在多種遞質的檢測中均已展現(xiàn)出一定優(yōu)勢，圖3B展示了一種MWCNT修飾的電極可實現(xiàn)的大比表面積多孔三維結構[101]。Goyal等[102]采用MWCNT修飾電極，基于方波脈沖法測定了吸煙人群血液中的腎上腺素，相較于未修飾的電極， MWCNT修飾電極可對腎上腺素氧化發(fā)揮催化活性， 進而升高電流并降低氧化電位， LOD可達到0.15nmol/L。

Xiang等[103]基于在碳纖維表面垂直排布的CNT陣列檢測了大鼠腦中抗壞血酸的濃度; 并通過在這些CNT陣列表面沉積鉑層的方法，制備了可檢測腦缺血/再灌注過程中氧氣濃度變化的傳感器[104]。

4.2?金屬納米鍍層和納米顆粒

大量研究證明， 在電極表面合成和沉積金屬納米材料是一種相對簡單的提高生物傳感器性能的方式[105，106]。 垂直排列的鎳納米線和鍍鉑鎳納米線修飾的電極可在不依賴酶的條件下實現(xiàn)谷氨酸濃度的電化學檢測。這些檢測電極總體檢測較靈敏并且比酶電極成本低，利于推廣（圖3C）[107]。研究表明，這種材料制成的電極可檢測濃度低于8 mmol/L的谷氨酸，而鎳納米線和鍍鉑鎳納米線修飾電極的LOD可分別達到68和83 μmol/L[108]。

另一種方式是基于仿生的原理， 通過金屬材料實現(xiàn)類似酶催化作用的電極材料[109]，因為多種酶的催化中心都通過不同的金屬離子實現(xiàn)催化作用，如使用銅離子復合物和銀納米顆粒修飾的玻碳電極可制備多巴胺傳感器。這種銅離子復合物材料可模仿酪氨酸酶的循環(huán)催化作用，特別是用雙氧水預處理電極的條件下可提高多巴胺檢測的峰電流值，從而提高檢測性能。另外，金屬納米顆粒在遞質傳感器中也有重要的應用，圖3D展示了一種金納米顆粒的結構特點[76]， 這種納米顆粒制成都的復合材料可有效檢測谷氨酸濃度。研究發(fā)現(xiàn)，銀納米顆粒對多巴胺的電催化效果遠強于未修飾的普通金屬電極。而通過在玻碳電極表面修飾氧化鎳納米顆粒和CNT材料， 并采用針對腎上腺素的雙十六烷基磷酸鹽膜覆蓋的方式制備的傳感器也可通過差分脈沖伏安法測定腎上腺素的濃度[110]，檢測范圍為0.3～9.5 μmol/L， LOD可達到82 nmol/L。

4.3?核酸適體

如圖2B所示，除了使用酶檢測神經遞質的方法，也可用通過檢測核酸適體的構像改變方式實現(xiàn)遞質分子的檢測[12，111]。即如圖中展示的多巴胺核酸適體傳感器[75]。 針對各種神經遞質分子的核酸適體均可通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化（Systematic evolution of ligands by exponential Enrichment，SELEX）過程篩選出來[112]，為傳感器的開發(fā)提供了便利條件。 人工合成的適體分子易于化學修飾，從而提高選擇性、響應時間和穩(wěn)定性等多種性質[113， 114]。通過適體5'端的巰基結合到金電極上，且在3'端結合亞甲基藍的方式，適體可在目標分子存在的時候改變構像從而拉近亞甲基藍分子和電極的距離，檢測電流變化即可測定目標分子濃度[115]，圖中ET表示電子傳遞（Electron transfer）。此技術響應時間為45～100 s，親和力可達微摩爾級， 并且可實現(xiàn)生理濃度下的分子檢測，而且該技術也被證實可在體檢測4.5 h以上。

Farjami等[116]通過計時電流法測定帶負電的核酸適體和帶正電的半胱氨酸修飾電極之間的相互作用，實現(xiàn)多巴胺濃度的測定，檢測范圍為100 nmol/L～5 mmol/L，采用電極表面鍍萘酚膜的方式，抗壞血酸和尿酸的干擾均可基本排除。通過調控適體與電極表面結合的靜電力[74]，還可進一步提高多巴胺分子的親和力，在最佳狀態(tài)下， 適體解離常數(shù)可達到（0.12±0.01 ）mmol/L。

然而， 核酸適體傳感器也面臨一些挑戰(zhàn)，由于缺乏穩(wěn)定的電極表面膜層， 可通過限制擴散而篩選帶電大分子，這類電極通常不能用于測定大分子濃度。但這些傳感器通常都可以測定藥用小分子在特定組織內的濃度。這些核酸適體有時會與不同的待測藥物分子反應，但對于藥用分子濃度測定而言， 這些限制通常不是決定性因素，因為在一般情況下， 這種藥物分子在體內不存在結構過度類似的分子，但這些傳感器測定神經系統(tǒng)內源性生物標記物分子可能會遇到困難，因為在組織內部這些分子的代謝過程中常有結構近似的分子，可能需要通過更多輪次的SELEX正向/負向選擇， 提高適體的特異性。另外，核酸適體等具備傳感功能的分子，由于其結構基礎與生物體本身的遺傳物質DNA相同，可能受到體內核酸內切酶等多種酶的催化降解作用。

5?神經遞質檢測技術的局限與展望

目前，遞質檢測技術受到了越來越多的重視，特別是與電生理和光遺傳等技術聯(lián)用的可能性吸引了神經科學和工程材料領域的共同關注。目前，基于導電聚合物和CNT等修飾材料的電極已被成功用于在體電生理研究[9，108，117～120]，神經電極修飾的COOH?CNT一方面可用于共價連接特定的修飾分子（如酶分子），從而實現(xiàn)在體傳感器的制備，也可用于快速循環(huán)伏安法測定多巴胺等遞質[121]; 另一方面，一些柔性神經電極材料也引起越來越多的關注[122]，而這些電極的聚合物導電尖端或者絕緣層也可能與在體電化學傳感器聯(lián)用，實現(xiàn)慢性植入下生物相容性更好的電化學檢測。一些新型的神經界面電極材料（如碳納米管束電極等）也可實現(xiàn)在體的分子檢測[123，124]。

然而，電生理和電化學檢測技術由于互相之間的電流滲漏而難以直接在系統(tǒng)中整合聯(lián)用，而開發(fā)異步分時采集電化學和電生理信號的技術相對易于實現(xiàn)[66]。一些實驗已證實，可在黑質中進行電生理記錄， 并在新紋狀體中采用電化學方法檢測下游的多巴胺濃度[125]。也有一些研究嘗試采用同一個電極陣列上不同位點分別采集電生理信號和電化學信號的方法，當記錄位點距離為200 μm時，計時電流法對場電位和單神經元活動的影響較小[126]。

一些電化學修飾材料除了可降低神經電極的阻抗，也可用于精準控制藥物釋放 [127]，這項技術可與電化學傳感器聯(lián)用， 而實現(xiàn)對某種或某些神經遞質的閉環(huán)調控。 這種對神經遞質閉環(huán)調控的概念逐漸受到研究者的重視[128]。

另一方面，光遺傳技術在神經科學中的應用日趨廣泛，如本能恐懼行為的皮層下通路[129， 130]與癲癇[131]、老年癡呆[132]等疾病的研究。目前，F(xiàn)SCV技術與光遺傳技術的結合已在社交孤立模型的環(huán)路機制研究等方面取得了一些重要進展[133]。但光遺傳技術與在體傳感器的結合仍處于應用早期，有廣闊的發(fā)展空間[134]。由于光遺傳技術使用的光纖也可用于在體熒光測定遞質濃度，兩者的結合可能為局部環(huán)路的閉環(huán)遞質濃度檢測與調控技術提供新的解決方案。 另外，由于光遺傳技術本身并不受電流的影響，因此光遺傳學調控神經元活動可與電化學遞質濃度檢測結合起來，從而避免電生理方法等與電化學聯(lián)用檢測遞質濃度過程中存在的各種障礙。

盡管面臨諸多機遇，但由于大腦的復雜性，在不破壞整體組織完整性的前提下檢測某種特定遞質濃度，仍要面對多種干擾物分子同時游離在檢測電極周圍的復雜情況，因而在體傳感器也面臨著許多挑戰(zhàn)：（1）電極尺寸需足夠小，從而能在盡可能不破壞大腦本身組織結構的情況下測定遞質濃度，而小電極尺寸也為具有更高空間精度的遞質檢測提供了可能; （2）在體遞質傳感器必須滿足快速響應和靈敏度高等特征，因而目前的各種技術均面臨一定挑戰(zhàn)，而高性能傳感器中，有的器件結構復雜、精密度高，會影響成品的優(yōu)良率，且會提升在體應用中喪失功能的風險; （3）高選擇性對分析技術十分重要，但是體內分子種類復雜多樣，因此生物傳感器檢測信號的解讀需格外慎重，多種在體檢測信號的聯(lián)用和交叉檢查可能提供更具參考性的信息，但可能顯著增加難度和開發(fā)周期; （4） 某些用于修飾的納米材料等對生物組織有潛在毒性，需謹慎考慮并測定這些因素的影響程度，特別是對潛在的在體應用; （5）蛋白質和細胞組織在電極表面的貼附會導致電極的生物污損或生物毒性效應，特別是利用多肽和核酸適體等分子的電極材料需慎重考慮內源性酶對這些分子的潛在降解，及其對傳感器在體壽命的影響。

通過遞質傳感器技術的改進、與其它神經技術的聯(lián)用以及針對在體環(huán)境設計與測試等方面的方法學推進，遞質檢測技術有望在闡明神經系統(tǒng)中各種疾病發(fā)生的機制和提供針對性治療方案等方面發(fā)揮更重要的作用。

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