紀(jì)文亮　張美寧　毛蘭群

摘?要?維生素C，又名抗壞血酸（Ascorbic acid， AA），是腦內(nèi)重要的小分子化學(xué)物質(zhì)，作為抗氧化劑和神經(jīng)調(diào)質(zhì)，在腦神經(jīng)生理與病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，因此，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中AA的測(cè)定越來(lái)越受到關(guān)注。傳統(tǒng)的檢測(cè)AA的方法需要復(fù)雜的樣品處理，時(shí)間分辨率不高，而AA在空氣中易于氧化，在電極上的氧化具有大的過(guò)電位。因此，選擇性高時(shí)空分辨率檢測(cè)AA具有很大挑戰(zhàn)。本文首先介紹了AA的電化學(xué)性質(zhì)，對(duì)通過(guò)設(shè)計(jì)電極表面的性質(zhì)，實(shí)現(xiàn)鼠腦和單細(xì)胞中AA的選擇性、高時(shí)空分辨率、實(shí)時(shí)分析的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。

關(guān)鍵詞?維生素C; 活體; 電化學(xué)分析; 選擇性; 評(píng)述

1?引 言

維生素C，又名抗壞血酸（Ascorbic acid， AA），是重要的水溶性維生素，具有防治壞血病的作用[1]。豚鼠、蝙蝠、靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物和人肝臟中由于缺少L?古洛糖酸內(nèi)酯氧化酶，所以無(wú)法自身合成，必須依賴食物攝取補(bǔ)充體內(nèi)所需的AA[2]。AA在體內(nèi)參與多種生理生化反應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)，AA可靶向抑制甘油醛?3?磷酸脫氫酶，選擇性地殺死KRAS和BRAF突變的結(jié)腸癌細(xì)胞[3]，可調(diào)控TET蛋白影響造血干細(xì)胞功能，抑制白血病的發(fā)生[4]。最近發(fā)現(xiàn)，在萊茵衣藻鑒定到一種新型的TET同源蛋白，該蛋白可將AA的碳基骨架轉(zhuǎn)移到DNA上產(chǎn)生一種全新的DNA修飾[5]。

此外，雖然AA在全身組織中的分布具有很大的差異性，但是在大多數(shù)動(dòng)物中，腦是AA含量最高的組織器官之一，且在腦內(nèi)具有重要的神經(jīng)生理功能。大量研究表明，AA在腦內(nèi)主要充當(dāng)抗氧化劑和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的角色[6，7]。首先，在生物體內(nèi)，AA作為一種強(qiáng)的還原劑，參與諸多的生理過(guò)程，通過(guò)其氧化反應(yīng)消除自由基，減少氧化應(yīng)激的損傷，如研究發(fā)現(xiàn)AA可緩解癲癇、腦缺血、腦水腫等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀[8～10]。其次，AA被認(rèn)為是腦內(nèi)重要的神經(jīng)調(diào)質(zhì)之一，研究表明，AA在腦內(nèi)的分布與兒茶酚類(lèi)和谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)分布密切相關(guān)，并作為重要輔酶因子，對(duì)去甲腎上腺素和多種神經(jīng)肽合成具有影響[1，11，12]。 Wang等[13]發(fā)現(xiàn)，嗜鉻細(xì)胞內(nèi)AA通過(guò)囊泡釋放，也說(shuō)明其可能作為調(diào)質(zhì)參與到神經(jīng)傳遞過(guò)程。

腦內(nèi)AA的分布具有一定區(qū)域性差異，胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞釋放機(jī)制復(fù)雜。AA是極性小分子化學(xué)物質(zhì)，且不能自由進(jìn)出細(xì)胞膜，所以不能通過(guò)單純擴(kuò)散的方式穿越細(xì)胞膜。大鼠腦內(nèi)AA的來(lái)源及濃度分布同人類(lèi)基本一樣，AA通過(guò)大腦的脈絡(luò)叢從血液中進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，然后擴(kuò)散到細(xì)胞間液，細(xì)胞間液中AA的濃度約為200～400 μmol/L，并且濃度可保持相對(duì)穩(wěn)定[14]。細(xì)胞間液的AA進(jìn)一步被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，神經(jīng)元內(nèi)AA濃度約為10 mmol/L，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)AA濃度約為1 mmol/L[15]。目前的研究表明，AA從細(xì)胞間液到細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制有兩種：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體控制的協(xié)同擴(kuò)散脫氫抗壞血酸（AA的氧化產(chǎn)物）的形式進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn); Na+依賴的AA轉(zhuǎn)運(yùn)體控制的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)[16，17]。與神經(jīng)遞質(zhì)不同，AA從細(xì)胞內(nèi)釋放的機(jī)制更加復(fù)雜，并不是單一的釋放過(guò)程。目前已報(bào)道的主要有3種：一種認(rèn)為AA是通過(guò)體積敏感陰離子通道實(shí)現(xiàn)釋放[18]; 另一種認(rèn)為AA可通過(guò)與谷氨酸異相交換機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞內(nèi)釋放至細(xì)胞外[1，19，20]; 也有文獻(xiàn)報(bào)道AA可與兒茶酚胺同時(shí)分泌到細(xì)胞外，而且AA的分泌與兒茶酚胺的分泌具有依賴細(xì)胞外Ca2+的一致性[21]?？傮w而言，AA釋放機(jī)制涉及諸多生理病理過(guò)程，例如胞吐、缺氧去極化、谷氨酸興奮毒性、水腫等。因此，可準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)、選擇性檢測(cè)不同腦區(qū)，不同層次AA的方法對(duì)于研究腦AA相關(guān)的神經(jīng)生理及病理過(guò)程具有重要意義[22]。

目前，有多種方法可實(shí)現(xiàn)不同時(shí)間空間分辨率條件下腦內(nèi)化學(xué)物質(zhì)的分析，如磁共振成像、功能磁共振腦成像、磁共振波譜、正電子發(fā)射斷層掃描和單光子發(fā)射斷層掃描、熒光成像等[23，24]。電分析化學(xué)方法具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)原位實(shí)時(shí)分析和多組分同時(shí)測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，在腦神經(jīng)科學(xué)研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在活體研究中受到了越來(lái)越多的關(guān)注和應(yīng)用[25～28]。目前，腦神經(jīng)電化學(xué)分析方法主要可分為微電極活體伏安法、微透析活體取樣?樣品分離?電化學(xué)檢測(cè)及微透析活體取樣?在線電化學(xué)檢測(cè)3種方法。其中活體伏安法和微透析活體取樣?在線電化學(xué)檢測(cè)，由于時(shí)間分辨率高，無(wú)需分離，在活體分析中的需求最大。但是，腦內(nèi)物質(zhì)繁多，不僅有小分子的物質(zhì)，更有大分子的蛋白，如何實(shí)現(xiàn)AA的高選擇性、穩(wěn)定的電化學(xué)分析具有很大的挑戰(zhàn)。本文簡(jiǎn)單介紹了AA的基礎(chǔ)電化學(xué)性質(zhì)，詳細(xì)地對(duì)如何在活的整體動(dòng)物層次和細(xì)胞層次上，實(shí)現(xiàn)不同時(shí)空分辨率的AA的選擇性分析的研究進(jìn)展進(jìn)行了評(píng)述。

2?抗壞血酸的電化學(xué)

如圖1所示，AA是有兩個(gè)可電離質(zhì)子的水溶性六元糖酸，pKa分別為4.2和11.8。在生理?xiàng)l件下，AA是帶負(fù)電荷的離子; 在中性條件下，AA的電化學(xué)氧化為一質(zhì)子、兩電子過(guò)程，其電化學(xué)氧化產(chǎn)物進(jìn)一步水解，生成二酮古洛糖酸[29，30]。雖然，AA在電極表面氧化電位是0.05 V （vs NHE），但由于AA氧化后的最終水解產(chǎn)物易吸附在電極表面，AA在一般電極上的氧化都具有大的過(guò)電位，導(dǎo)致其氧化電位和腦內(nèi)共存的其它電化學(xué)活性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)（如多巴胺（Dopamine， DA）、二羥基苯乙酸（3，4?Dihydroxyphenylacetic acid， DOPAC）、腎上腺素（Epinephrine， E）、去甲腎上腺素（Norepinephrine， NE）、5?羥色胺（5?Hydroxytryptamine，5?HT）等）的氧化電位無(wú)法分開(kāi)，使得AA的選擇性分析具有很大的挑戰(zhàn)。

在大多數(shù)碳電極表面，AA是一種內(nèi)殼層活性物質(zhì)，在電極上的電化學(xué)行為與電極的表面化學(xué)性質(zhì)密切相關(guān)。碳電極，如玻碳電極、高定向熱解石墨電極（Highly oriented pyrolytic graphite， HOPG）和金剛石電極，其結(jié)構(gòu)與電化學(xué)活性之間的關(guān)系一般由以下一個(gè)或幾個(gè)因素決定：電極表面微結(jié)構(gòu)、表面潔凈程度、電子結(jié)構(gòu)以及表面官能團(tuán)等。研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)處理的碳電極可加快AA的電子轉(zhuǎn)移速度[31，32]。Guo等[33]通過(guò)調(diào)控石墨炔的電子態(tài)和化學(xué)界面，發(fā)現(xiàn)AA在化學(xué)還原和電化學(xué)還原的石墨炔上的電子轉(zhuǎn)移速率比石墨炔和氧化的石墨炔電極上的快。最近，Xiao等[34]系統(tǒng)研究了不同碳纖維對(duì)AA電化學(xué)氧化的影響（圖2）。 他們選取3種來(lái)源的碳纖維電極（Carbon fiber microelectrode， CFE，Type?1，Type?2和Type?3 CFEs），將CFE分別在酸溶液（0.5 mol/L H2SO4）和堿溶液（1.0 mol/L NaOH）中進(jìn)行電化學(xué)處理。在硫酸和堿溶液中電化學(xué)處理的Type?1和Type?3 CFE可顯著增加AA的電子轉(zhuǎn)移速率（圖2A和2C），但經(jīng)處理的Type?2 CFE 對(duì)AA的氧化卻無(wú)顯著改變（圖2B）。研究表明，由于電極表面的含氧官能團(tuán)、表面結(jié)構(gòu)（如缺陷）及電子態(tài)密度與CFE來(lái)源和電化學(xué)預(yù)處理密切相關(guān)，因此，電極對(duì)于AA的電化學(xué)氧化的催化活性與所采用的處理?xiàng)l件和碳纖維的來(lái)源有著密切的聯(lián)系，且表現(xiàn)出較大差異。

用化學(xué)物質(zhì)修飾電極表面，調(diào)控AA在電極表面的電化學(xué)過(guò)程是實(shí)現(xiàn)高選擇性檢測(cè)AA的有效策略。通常，在裸金電極表面，由于AA氧化產(chǎn)物在電極表面的吸附 AA的氧化峰電位約為0.5 V。 Raj等[35]將有機(jī)硫化合物，如2，2?二硫代雙乙胺和6，6?二硫代雙己胺，通過(guò)AuS鍵在金電極表面形成單分子自組裝膜（Self?assembled monolayer， SAM），由于SAM末端的正電荷和帶負(fù)電AA之間的靜電相互作用，AA的氧化峰電位負(fù)移了約0.45 V，而在SAM組裝電極上，DA的氧化電位約為0.2 V，實(shí)現(xiàn)了用微分脈沖伏安法Differential pulse voltammetry， DPV）選擇性分析AA。

利用材料提高AA電子轉(zhuǎn)移速率從而實(shí)現(xiàn)AA的選擇性分析是另外一種有效的策略。碳納米管（Carbon nanotube， CNT）具有獨(dú)特的電子、化學(xué)、光學(xué)和機(jī)械性能。早期的研究表明，CNT側(cè)壁碳的性質(zhì)與HOPG電極的層狀碳類(lèi)似，其電化學(xué)性質(zhì)不活潑。相反地，CNT的端口碳的性質(zhì)類(lèi)似于HOPG電極的邊緣碳，而具有很好的電化學(xué)活性。Zhang等[36]利用硝酸和硫酸混酸切割的單壁碳納米管（Single?walled carbon nanotube，SWNT）表面帶負(fù)電荷的性質(zhì)，將其和具有正電荷性質(zhì)的聚二烯丙基二甲基氯化銨通過(guò)靜電作用逐層組裝在基底電極上，組裝的SWNT電極對(duì)AA具有很好的催化性能。他們進(jìn)一步系統(tǒng)研究了AA在裸玻碳電極、石墨、SWNT、真空高溫處理的SWNT不同碳材料電極上的電化學(xué)行為。從圖3K可見(jiàn)，AA在SWNT電極上的氧化電位比在玻碳電極和石墨修飾電極上的氧化電位負(fù)，說(shuō)明 SWNT電極降低了AA的過(guò)電位，加速了AA的電子轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)。從AA在純化的 SWNT電極上的響應(yīng)（圖3）可見(jiàn)，含氧官能團(tuán)的氧化還原峰并未發(fā)生變化，所以SWNT的含氧官能團(tuán)沒(méi)有影響AA的催化。同時(shí)他們發(fā)現(xiàn)，AA在未純化的 SWNT和酸純化的 SWNT電極上的電化學(xué)行為沒(méi)有明顯的區(qū)別，所以SWNT中所含的雜質(zhì)不是引起AA電子轉(zhuǎn)移加快的原因。盡管AA在SWNT上電催化性能還需進(jìn)一步研究，但推測(cè)AA在SWNT電極上快的電子轉(zhuǎn)移可能與SWNT碳結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3?活體原位電化學(xué)分析

活體伏安法是將微電極直接插入大腦特定部位，實(shí)現(xiàn)腦內(nèi)生理活性物質(zhì)的活體實(shí)時(shí)分析的電化學(xué)分析方法[37]。因其所用微電極尺寸小，可置入腦組織，分析時(shí)空分辨率高，活體伏安法在腦神經(jīng)化學(xué)過(guò)程的研究中備受關(guān)注[38～40]。Adams等[41]于1972年第一次將碳糊電極（直徑約300 μm）植入大鼠腦內(nèi)，并獲得了腦內(nèi)第一張循環(huán)伏安圖，并猜測(cè)所獲得的伏安信號(hào)為AA的氧化峰。用同樣的方法，O'Neill等[42]通過(guò)腦區(qū)微注射和腹腔注射AA，增加了伏安信號(hào)，Brazell等[43]通過(guò)向腦區(qū)注射AA選擇性氧化酶（Ascorbate oxidase， AAOx），證實(shí)了獲得的伏安信號(hào)為AA，并用該方法測(cè)定了不同腦區(qū)和微注射谷氨酸時(shí)AA的變化。然而，碳糊電極直徑太大，碳纖維電極（CFE，5～7 μm）具有較高空間分辨率和生物兼容性等性能，因此，越來(lái)越多研究開(kāi)始關(guān)注CFE，并發(fā)展了許多檢測(cè)AA的方法[44～47]。Gonon等[48]第一次對(duì)CFE進(jìn)行處理（圖4A），用DPV法實(shí)現(xiàn)了腦內(nèi)AA的選擇性分析。Heien等[49]通過(guò)快速掃描循環(huán)伏安法（Fast scan cyclic voltammetry， FSCV）和主成分回歸分析對(duì) FSCV 數(shù)據(jù)進(jìn)行了多組分分析，可同時(shí)測(cè)定AA、5?HT、DA、DOPAC、pH值的實(shí)時(shí)變化（圖4B）。

如前所述，對(duì)電極表面進(jìn)行合理的功能化[50～53]，是實(shí)現(xiàn)AA選擇性分析的有效策略。Zhang等[36]

第一次在電極表面修飾CNT，實(shí)現(xiàn)了AA的活體檢測(cè)。AA在CNT修飾的CFE上在 0.0 V左右達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流，說(shuō)明修飾在CFE上的CNT對(duì)AA具有很好的電化學(xué)催化作用。此外，DA、尿酸和5?HT這些腦內(nèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的氧化電位都比AA在CNT修飾的CFE氧化電位正，因此不干擾AA的電化學(xué)分析。他們通過(guò)多壁碳納米管（Multiwalled carbon nanotube， MWNT）修飾的CFE，用DPV的方法檢測(cè)鼠腦細(xì)胞間液中AA的濃度約為 （0.20±0.05） mmol/L。他們通過(guò)向電極附近注入AAOx，證明MWNT修飾的CFE電極對(duì)AA具有很好的選擇性[54]（見(jiàn)圖5）。

由于CNT修飾CFE的技術(shù)在神經(jīng)科研領(lǐng)域的研究較難，且電極制備的可重復(fù)性有待進(jìn)一步提高，Xiang等[55]制備了陣列碳納米管覆蓋的碳纖維微電極（Vertically aligned carbon nanotube sheathed carbon fiber， ?VACNT?CFE），大大簡(jiǎn)化了碳納米管微電極的制備方法，避免了手工滴涂修飾CNT引起的電極性能差異，以及繁雜修飾步驟。圖6為CFE （A）和VACNT?CFE （B）的

掃描電鏡圖，CNT均勻生長(zhǎng)在CFE表面，在稀H2SO4溶液中電化學(xué)預(yù)處理，得到的VACNT?CFE對(duì)AA的響應(yīng)與裸CFE相似，然而，VACNT?CFE在NaOH溶液中電化學(xué)活化后，表現(xiàn)出對(duì)AA良好的電催化性能，降低了AA氧化的過(guò)電位，并增大了其電流響應(yīng)，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了CNT的端口碳對(duì)AA具有良好的催化性能。VACNT?CFE對(duì)AA的分析呈現(xiàn)出良好的選擇性和線性關(guān)系，并可觀察到灌注谷氨酸所引起的AA釋放，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)了AA和谷氨酸的異相交換行為（圖6E）。

在CFE表面垂直生長(zhǎng)CNT方法可用于腦內(nèi)AA測(cè)定，雖然該電極制備方法可避免人工修飾引起的一系列問(wèn)題，但是該方法復(fù)雜，不利于大量制備電極。為進(jìn)一步簡(jiǎn)化CNT電極的制備，Xiao等[34]發(fā)展了一種可控且重現(xiàn)性極高的電泳沉積SWNT修飾電極的方法，電泳的方法可非常簡(jiǎn)單地將酸化處理的SWNT沉積到CFE表面，該電極對(duì)AA的電化學(xué)氧化表現(xiàn)出良好的催化作用，重現(xiàn)性高（如圖7）。

重要的是，檢測(cè)AA時(shí)，CNT修飾的CFE比電化學(xué)處理的CFE具有更好的穩(wěn)定性，因此有利于研究腦科學(xué)與AA相關(guān)的生理或者病理過(guò)程中AA變化。如擴(kuò)散性抑制（Spreading depression， SD）是一種在腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞去極化，隨后受到抑制并類(lèi)似去極化波在神經(jīng)及膠質(zhì)細(xì)胞間進(jìn)行傳播的現(xiàn)象。SD發(fā)病過(guò)程與偏頭痛、癲癇發(fā)病過(guò)程非常相似[56]。因此SD發(fā)病過(guò)程中機(jī)理的研究，對(duì)于相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制的研究和治療都有重要的參考意義。Xiao等[57]用SWNT修飾的CFE測(cè)定了鼠腦皮層由電刺激引發(fā)的SD過(guò)程中AA的濃度動(dòng)態(tài)變化。如圖8A和8B 所示，利用給予局部注射AAOx和改變施加電位的方式，進(jìn)一步驗(yàn)證記錄到的電流的變化是由SD導(dǎo)致胞外AA濃度變化引起的。為進(jìn)一步理解SD過(guò)程中AA釋放的機(jī)理，局部注射N(xiāo)MDA受體拮抗劑地佐環(huán)平（MK?801）阻斷谷氨酸依賴的SD的傳播，并可抑制SD過(guò)程中AA的釋放（圖8C），進(jìn)一步證明了AA的釋放受SD過(guò)程中谷氨酸的調(diào)節(jié)。為了探索AA的釋放是否是由于谷氨酸異相交換引起的，采用D，L?蘇式?β?芐氧基天冬氨酸（D，L?TBOA）進(jìn)行干預(yù)，大鼠給予D，L?TBOA 后，發(fā)現(xiàn)電刺激AA的釋放并未被抑制（圖8D）。因此，報(bào)道認(rèn)為SD過(guò)程中AA釋放并不是谷氨酸的異相交換引起的，可能與SD過(guò)程中細(xì)胞水腫密切相關(guān)。

比率型電分析引入內(nèi)參比氧化還原電對(duì)，使用待分析物和內(nèi)參比的電流響應(yīng)對(duì)分析物進(jìn)行分析，可克服復(fù)雜體系的基底效應(yīng)。Tian研究組[58，59]首次提出比率型電分析策略，并將CNT紡成碳纖維絲，制備得到CNT纖維（Carbon nanotube fiber， CNF），實(shí)現(xiàn)了活體內(nèi)比率型AA的分析檢測(cè)。如圖9所示， AA在CNF上的氧化電位為50 mV，利用DPV技術(shù)，結(jié)合比率型電化學(xué)方法，對(duì)腦內(nèi)的AA 實(shí)現(xiàn)了選擇性分析，采用該方法觀察到到老年癡呆癥大鼠皮層、紋狀體和海馬3個(gè)腦區(qū)AA含量明顯低于正常大鼠。Cheng等[60]將硫瑾固定在炭黑修飾的CFE上，結(jié)合比率型電化學(xué)，用循環(huán)伏安法選擇性檢測(cè)聽(tīng)皮層的AA，并觀察到水楊酸鈉引起的耳鳴過(guò)程中AA的變化。

同時(shí)記錄神經(jīng)元的電活動(dòng)信息以及腦內(nèi)AA的動(dòng)態(tài)變化可將神經(jīng)細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞與AA密切相關(guān)的神經(jīng)調(diào)節(jié)過(guò)程聯(lián)系起來(lái)，從而深入理解腦生理和病理過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[61]。Cheng等[62]將SWNT修飾的CFE和毛細(xì)管玻璃微電極有效集成為雙通道微電極（Integrated dual?mode microelectrode， IDMME），用CFE選擇性記錄AA，用玻璃管微電極記錄電生理信號(hào)，該雙通道微電極可獨(dú)立記錄化學(xué)和電信號(hào)，兩種信號(hào)之間沒(méi)有交叉干擾，并成功地用于原位連續(xù)監(jiān)測(cè)大鼠腦缺血/再灌注過(guò)程中AA以及神經(jīng)元細(xì)胞電活動(dòng)的動(dòng)態(tài)變化。

生物大分子在電極表面的吸附是活體原位分析AA面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)槟X內(nèi)環(huán)境較復(fù)雜，不僅存在許多小分子干擾物質(zhì)，還包含許多生物大分子（如脂質(zhì)，蛋白質(zhì)）[63]。電極植入后腦內(nèi)生物大分子會(huì)在電極表面吸附，導(dǎo)致電極檢測(cè)靈敏度下降，使得電極必須在活體檢測(cè)后進(jìn)行校正，才能對(duì)活體數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。Liu等[64]發(fā)現(xiàn)，用牛血清蛋白（Bovine serum albumin， BSA）處理后的CNT修飾CFE電極的活體檢測(cè)前校準(zhǔn)曲線和活體檢測(cè)后校準(zhǔn)曲線基本一致，從而巧妙地實(shí)現(xiàn)了活體前校準(zhǔn)，克服了活體檢測(cè)過(guò)程中或者活體分析后微電極取出時(shí)電極斷裂無(wú)法校準(zhǔn)的問(wèn)題。

4?活體微透析取樣?在線電化學(xué)分析

微透析技術(shù)是一種從生物活體內(nèi)進(jìn)行動(dòng)態(tài)微量生化采樣的技術(shù)，最早由Delgado提出并申請(qǐng)了美國(guó)專利， Ungerstedt等[65]于1982年報(bào)道了采用微透析技術(shù)檢測(cè)DA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并于1987年申請(qǐng)了現(xiàn)在應(yīng)用最為廣泛的同心型探針的專利。微透析活體取樣?色譜分離?電化學(xué)檢測(cè)方法是將微透析液首先經(jīng)過(guò)高效液相色譜或毛細(xì)管電泳分離，然后進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。這種方法中對(duì)電極的選擇性要求不苛刻，方法簡(jiǎn)單，廣泛地應(yīng)用于腦神經(jīng)化學(xué)過(guò)程中生理活性物質(zhì)的檢測(cè)以及生理和病理過(guò)程的研究[66]。如Lee等[67]用微透析取樣?色譜分離?電化學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)了腦內(nèi)的AA。雖然微透析取樣?色譜分離?電化學(xué)檢測(cè)方法的建立比較容易，但是這種分析方法必須首先收集微透析樣品，然后用色譜 （或者電泳） 分離，再進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。樣品收集和色譜分離需要的時(shí)間都很長(zhǎng)，因此方法的時(shí)空分辨率低，而且樣品在收集過(guò)程中AA容易被氧化而失真。盡管Qian等[68]設(shè)計(jì)了毛細(xì)管電泳分離?電化學(xué)檢測(cè)DA的芯片，將樣品收集的時(shí)間縮短為1 min，同時(shí)也縮短了分離的時(shí)間，但是，微透析活體取樣?樣品分離?電化學(xué)檢測(cè)方法仍然存在一些問(wèn)題，需進(jìn)一步完善。

微透析取樣?電化學(xué)在線檢測(cè)系統(tǒng)（Online electrochemical system， OECS）無(wú)需分離，樣品保真程度高，樣品取出后直接電化學(xué)檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)近似實(shí)時(shí)的分析。Zhang等[53]第一次利用CNT修飾的玻碳電極，結(jié)合微透析技術(shù)，提出并建立了AA的活體、在線電化學(xué)分析新技術(shù)和新方法。該方法具有很好的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。大鼠活體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常狀態(tài)下大鼠紋狀體透析液中的AA濃度為（5.0±0.5） μmol/L （n=5），將專一催化AA氧化的AAOx與aCSF混合作為灌流液，如圖10所示，電流值基本無(wú)變化，說(shuō)明透析液中其它神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)不干擾AA的測(cè)定。

基于CNT修飾電極所構(gòu)建的在線電化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)于AA的響應(yīng)在一定范圍內(nèi)不隨腦內(nèi)氧氣和pH值的改變而變化，穩(wěn)定性好，有利于連續(xù)監(jiān)測(cè)AA在各種生理/病理過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，探索AA的神經(jīng)化學(xué)機(jī)制[69]。Liu等[70]利用該系統(tǒng)研究了腦缺血過(guò)程中腦內(nèi)AA的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了大鼠紋狀體腦區(qū)AA濃度在不同腦缺血/再灌注過(guò)程中的變化差異，以及同樣程度的2?VO全腦缺血所導(dǎo)致的AA在紋狀體、皮層感覺(jué)運(yùn)動(dòng)區(qū)、背側(cè)海馬和腹側(cè)海馬4個(gè)腦區(qū)的空間變化差異[71]; 同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了2?VO全腦缺血后早期靜脈注射抗氧化劑（如AA，谷胱甘肽）能有效抑制海馬區(qū)的AA在缺血后的上升[9]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于深刻理解腦缺血病理過(guò)程中與AA相關(guān)的神經(jīng)化學(xué)機(jī)制具有重要意義。

活體多組分的檢測(cè)對(duì)理解AA相關(guān)的生理病理分子機(jī)制具有重要作用，因?yàn)樵谶@些生理病理的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中，常伴隨著多種物質(zhì)的同時(shí)變化，如能量代謝物質(zhì)（如葡萄糖，乳酸）和各種離子（如Ca2+、Mg2+）等。商品化的可用于在線電化學(xué)檢測(cè)的電極形狀固定限制了多組分檢測(cè)[72]。微流控芯片技術(shù)因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)（如流路的可設(shè)計(jì)性，樣品量需求少等[73，74]）而廣泛應(yīng)用于生物分析。Lin等[75]設(shè)計(jì)了一個(gè)聚二甲基硅氧烷（Poly（dimethylsiloxane）， PDMS）微流控芯片，工作電極為CNT修飾的銦錫氧化物（Indium?tin oxide， ITO）電極，Ag/AgCl電極為參比電極，Pt絲電極為對(duì)電極，對(duì)微透析液中的AA實(shí)現(xiàn)了選擇性連續(xù)分析。

連續(xù)檢測(cè)腦內(nèi)的AA和Mg2+具有重要的生理病理意義，因?yàn)槟X內(nèi)的很多生理病理活動(dòng)中都伴隨兩種物質(zhì)的變化[76]。Gao等[77]設(shè)計(jì)了可連續(xù)檢測(cè)AA和Mg2+的微透析取樣?微流控在線電化學(xué)分析系統(tǒng)， 在同一個(gè)通道內(nèi)內(nèi)嵌兩個(gè)電極，分別修飾CNT和聚甲苯胺藍(lán)，選擇性檢測(cè)AA和Mg2+， 方法具有高的選擇性和穩(wěn)定性。測(cè)得腦透析液中AA和Mg2+濃度分別為21.9和139.4 μmol/L，全腦缺血后AA和Mg2+濃度分別下降了20.9%和31.3%

微流控芯片還可通過(guò)設(shè)計(jì)流路，實(shí)現(xiàn)兩種以上物質(zhì)的檢測(cè)。Lin等[78]建立了可同時(shí)檢測(cè)葡萄糖、乳酸和AA的微透析取樣?微流控在線分析系統(tǒng)。通過(guò)巧妙設(shè)計(jì)微透析的進(jìn)樣、輔酶和微透析液的混合、電極的排列形式，避免3個(gè)電極之間的交叉干擾，設(shè)計(jì)了如圖11所示的微流控芯片。

在流路的上游用CNT修飾的ITO電極檢測(cè)AA，在流路的下游用兩個(gè)平行的電極分別修飾用亞甲基綠（Methylene green， MG）吸附的CNT和脫氫酶，分別檢測(cè)葡萄糖和乳酸，有效避免了3個(gè)電極之間的交叉干擾，并用該體系觀察了大鼠腦缺血/再灌注過(guò)程中腦內(nèi)AA、葡糖糖和乳酸的變化規(guī)律，深刻理解了腦缺血病理過(guò)程中相關(guān)的神經(jīng)化學(xué)機(jī)制[79，80]。

5?單細(xì)胞安培法

單細(xì)胞安培法是一種具有高時(shí)空分辨率的電化學(xué)方法，可記錄到單細(xì)胞水平神經(jīng)遞質(zhì)，如兒茶酚胺類(lèi)[81～83]。 Wang等[13]發(fā)現(xiàn)用堿性條件處理的CFE對(duì)AA具有很好的選擇性，并首次觀察到AA類(lèi)似囊泡釋放的釋放行為。如圖12所示，給予細(xì)胞10 s的高鉀溶液刺激后，單細(xì)胞安培法明顯記錄到了大量分泌信號(hào)，且該信號(hào)與普通碳纖維記錄到的兒茶酚胺通過(guò)囊泡釋放的現(xiàn)象具有一致性。為進(jìn)一步驗(yàn)證獲取的信號(hào)為分泌的AA，用高濃度AAOx孵育細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)未孵育的細(xì)胞裂解液中的氧化電流消失，說(shuō)明該電極檢測(cè)到的是AA的釋放。為了進(jìn)一步驗(yàn)證AA是囊泡釋放，他們利用囊泡的釋放依賴于細(xì)胞外液中Ca2+濃度的經(jīng)典理論，將標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞外液替換為不含有Ca2+的細(xì)胞外液后，再次給予細(xì)胞相同的高鉀刺激后，觀察不到分泌信號(hào)。以上結(jié)果證明了AA可通過(guò)囊泡的形式進(jìn)行胞吐釋放。同時(shí)，為進(jìn)一步確認(rèn)信號(hào)是由AA引起的，而非噪聲，他們將鉗制電壓由0 V變?yōu)?.2 V，發(fā)現(xiàn)類(lèi)似囊泡釋放樣的信號(hào)消失。這進(jìn)一步證明AA胞吐現(xiàn)象不是噪聲引起。該研究為AA的囊泡釋放提供了最直接的證據(jù)，有利于深入探討AA的釋放機(jī)制，為神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展提供了方法。

6?結(jié)論與展望

本文對(duì)近期AA的高時(shí)空分辨率的電化學(xué)方法和技術(shù)進(jìn)行了評(píng)述，這些方法將為AA相關(guān)的生理和病理的研究提供有力的方法學(xué)保證，如CFE選擇性分析AA促使首次利用CFE發(fā)現(xiàn)AA的胞吐行為，推動(dòng)了與AA相關(guān)的生理和病理的研究。本文所述方法可實(shí)現(xiàn)AA的選擇性分析， 隨著其它學(xué)科的發(fā)展，如材料科學(xué)、微加工技術(shù)、電子信息技術(shù)等， 這些方法將會(huì)得到進(jìn)一步發(fā)展。另外，電化學(xué)方法與生理學(xué)技術(shù)（如光遺傳、電生理和成像等）聯(lián)用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多種方法和技術(shù)的高度集成，也將是AA方法學(xué)未來(lái)發(fā)展的主要方向之一。

References

1?Rice M E. Trends Neurosci.， 2000， ?23（5）： 209-216

2?Nandi A， Mukhopadhyay C K， Ghosh M K， Chattopadhyay D J， Chatterjee I B. Free Radic. Biol. Med.， 1997， 22（6）： 1047-1054

3?Yun J， Mullarky E， Lu C， Bosch K N， Kavalier A， Rivera K， Roper J， Chio II， Giannopoulou E G， Rago C， Muley A， Asara J M， Paik J， Elemento O， Chen Z， Pappin D J， Dow L E， Papadopoulos N， Gross S S， Cantley L C. Science， 2015， ?350（6266）： 1391-1396

4?Agathocleous M， Meacham C E， Burgess R J， Piskounova E， Zhao Z， Crane G M， Cowin B L， Bruner E， Murphy M M， Chen W， Spangrude G J， Hu Z， DeBerardinis R J， Morrison S J. Nature， 2017， ?549（7673）： 476-481

5?Xue J， Chen G， Hao F， Chen H， Fang Z， Chen F， Pang B， Yang Q， Wei X， Fan Q， Xin C， Zhao J， Deng X， Wang B， Zhang X， Chu Y， Tang H， Yin H， Ma W， Chen L， Ding J， Weinhold E， Kohli R M， Liu， Zhu Z， Huang K， Tang H， Xu G. Nature， 2019， ?569（7757）： 581-585

6?Rebec G V， Wang Z. J. Neurosci.， 2001， ?21（2）： 668-675

7?Dutta A， Gautam R， Chatterjee S， Ariese F， Sikdar S K， Umapathy S. ACS Chem. Neurosci.， 2015， ?6（11）： 1794-1801

8?Dong Y， Wang S， Zhang T， Zhao X， Liu X， Cao L， Chi Z. Brain Res.， 2013， ?1535： 115-123

9?Liu K， Yu P， Lin Y， Wang Y， Ohsaka T， Mao L. Anal. Chem.， 2013， ?85（20）： 9947-9954

10?Brahma B， Forman R E， Stewart E E， Nicholson C， Rice M E. J. Neurochem.， 2000， ?74（3）： 1263-1270

11?Levine M， Morita K， Heldman E， Pollard H B. J. Biol. Chem.， 1985， ?260（29）： 15598-15603

12?Meredith M E， May J M. Brain Res.， 2013， ?1539： 7-14

13?Wang K， Xiao T， Yue Q， Wu F， Yu P， Mao L. Anal. Chem.， 2017， ?89（17）： 9502-9507

14?Harrison F E， Dawes S M， Meredith M E， Babaev V R， Li L， May J M. Free Radic. Biol. Med.， 2010， ?49（5）： 821-829

15?Rice M E， Forman R E， Chen B， Avshalumov M V， Cragg S J， Drew K L. Comp. Biochem. Physiol. C Toxicol. Pharmacol.， 2002， ?133（4）： 515-525

16?Corti A， Casini A F， Pompella A. Arch. Biochem. Biophys.， 2010， ?500（2）： 107-115

17?Huang J， Agus D B， Winfree C J， Kiss S， Mack W J， McTaggart R A， Choudhri T F， Kim L J， Mocco J， Pinsky D J， Fox W D， Israel R J， Boyd T A， Golde D W， Connolly E S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2001， ?98（20）： 11720-11724

18?Knoth J， Viveros O H， Diliberto E J. J. Biol. Chem.， 1987， ?262（29）： 14036-14041

19?Grunewald R A， Fillenz M. Neurochem. Int.， 1984， ?6（4）： 491-500

20?Wilson J X， Peters C E， Sitar S M， Daoust P， Gelb A W. Brain. Res.， 2000， ?858（1）： 61-66

21?Daniels A J， Dean G， Viveros O H， Diliberto E J. Science.， 1982， ?216（4547）： 737-739

22?QIN Tai?Chun， LI Xiao?Gang， HAO Jie， MAO Lan?Qun. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， ?43（3）： 457-462

秦泰春， 李曉鋼， 郝 潔， 于 萍， 毛蘭群. 分析化學(xué)， 2015， ?43（3）： 457-462

23?Michael A C， Borland， L M. CRC Press： Boca Raton， FL， 2006

24?Robinson D L， Hermans A， Seipel A T， Wightman R M. Chem. Rev.， 2008， ?108（7）： 2554-2584

25?Wu F， Yu P， Mao L. Chem. Soc. Rev.， 2017， ?46（10）： 2692-2704

26?Yu P， He X， Mao L. Chem. Soc. Rev.， 2015， ?44（17）： 5959-5968

27?Wang Y， Mao L. Electroanalysis， 2016， ?28（2）： 265-276

28?Wu F， Yu P， Mao L. ACS Omega， 2018， ?3（10）： 13267-13274

29?Prieto F， Coles B A， Compton R G. J. Phys. Chem. B， 1998， ?102（38）： 7442-7447

30?Cheng H， Li L， Zhang M， Jiang Y， Yu P， Ma F， Mao L. TrAC?Trends Anal. Chem.， 2018， ?109： 247-259

31?Hu I， Kuwana T. Anal. Chem.， 1986， ?58（14）： 3235-3239

32?Deakin M R， Kovach P M， Stutts K J， Wightman R M. Anal. Chem.， 1986， ?58（7）： 1474-1480

33?Guo S， Yan H， Wu F， Zhao L， Yu P， Liu H， Li Y， Mao L. Anal. Chem.， 2017， ?89（23）： 13008-13015

34?Xiao T， Jiang Y， Ji W， Mao L. Anal. Chem.， 2018， ?90（7）： 4840-4846

35?Raj C R， Ohsaka T. J. Electroanal. Chem.， 2001， ?496（1?2）： 44-49

36?Zhang M， Liu K， Gong K， Su L， Chen Y， Mao L. Anal. Chem.， 2005， ?77（19）： 6234-6242

37?Xiang L， Yu P， Zhang M， Hao J， Wang Y， Zhu L， Dai L， Mao L. Anal. Chem.， 2014， ?86（10）： 5017-5023

38?Xiao T， Wu F， Hao J， Zhang M， Yu P， Mao L. Anal. Chem.， 2017， ?89（1）： 300-313

39?Li R， Liu X， Qui W， Zhang M. Anal. Chem.， 2016， ?88（15）： 7769-7776

40?Li R， Guo D， Ye J， Zhang M. Analyst， 2015， ?140（11）： 3746-3752

41?Adams R N， Murrill E， McCreery R， Blank L， Karolczak M. Eur. J. Pharmacol.， 1972， ?17（2）： 287-292

42?O'Neill R D， Grunewald R A， Fillenz M， Albery W J. Neuroscience， 1982， ?7（8）： 1945-1954

43?Brazell M P， Marsden C A. Brain Res.， 1982， ?249（1）： 167-172

44?Dayton M A， Ewing A G， Wightman R M. Anal. Chem.， 1980， ?52（14）： 2392-2396

45?Gonon F， Buda M， Cespuglio R， Jouvet M， Pujol J F. Brain Res.， 1981： ?223（1）： 69-80

46?Ewing A G， Wightman R M， Dayton M A. Brain Res.， 1982， ?249（2）： 361-370

47?Stamford J A， Kruk Z L， Millar J. Brain Res.， 1984， ?299（2）： 289-295

48?Gonon F， Buda M， Cespuglio R， Jouvet M， Pujol J F. Nature， 1980， ?286（5776）： 902-904

49?Heien M L， Johnson M A， Wightman R M. Anal. Chem.， 2004， ?76（19）： 5697-5704

50?Wang J， Tuzhi P， Villa V. J. Electroanal. Chem.， 1987， ?234（1?2）： 119-131

51?Capella P， Ghasemzadeh B， Mitchell K， Adams R N. Electroanalysis， 1990， ?2（3）： 175-182

52?Feng J X， Brazell M， Renner K， Kasser R， Adams R N. Anal. Chem.， 1987， ?59（14）： 1863-1867

53?Zhang M， Yu P， Mao L. Acc. Chem. Res.， 2012， ?45（4）： 533-543

54?Zhang M， Liu K， Xiang L， Lin Y， Su L， Mao L. Anal. Chem.， 2007， ?79（17）： 6559-6565

55?Xiang L， Yu P， Hao J， Zhang M， Zhu L， Dai L， Mao L. Anal. Chem.， 2014， ?86（8）： 3909-3914

56?Pietrobon D， Moskowitz M A. Nat. Rev. Neurosci.， 2014， ?15（6）： 379-393

57?Xiao T， Wang Y， Wei H， Yu P， Jiang Y， Mao L. Angew. Chem. Int. Edit.， 2019， ?58（20）： 6616-6619

58?Zhang L， Liu F， Sun X， Wei G， Tian Y， Liu Z， Huang R， Yu Y， Peng H. Anal. Chem.， 2017， ?89（3）： 1831-1837

59?Chai X， Zhou X， Zhu A， Zhang L， Qin Y， Shi G， Tian Y. Angew. Chem. Int. Edit.， 2013， ?52（31）： 8129-8133

60?Cheng H， Wang X， Wei H. Anal. Chem.， 2015， ?87（17）： 8889-8895

61?XU Sheng?Wei， WANG Li， SONG Xian?Teng， ZHANG Song， WANG Mi?Xia， YU Ping， MAO Lan?Qun. CAI Xin?Xia. Chinese J. Anal. Chem.， 2016， ?44（9）： 1458-1464

徐聲偉， 王 力， 宋先騰， 張 松， 王蜜霞， 于 萍， 毛蘭群， 蔡新霞. 分析化學(xué)， 2016， ?44（9）： 1458-1464

62?Cheng H， Xiao T， Wang D， Hao J， Yu P， Mao L. J. Electroanal. Chem.， 2016， ?781： 90-96

63?Liu X， Xiao T， Wu F， Shen M?Y， Zhang M， Yu H， Mao L. Angew. Chem. Int. Edit.， 2017， ?56（39）： 11802-11806

64?Liu X， Zhang M， Xiao T， Hao J， Li R， Mao L. Anal. Chem.， 2016， ?88（14）： 7238-7244

65?Ungerstedt U， Herrera?Marschitz M， Jungnelius U， Stahle L， Tossman U， Zetterstrm T. Advances in Dopamine Research， 1982： 219-231

66?Yue X， Zhu Z， Zhang M， Ye Z. Anal. Chem.， 2015， ?87（3）： 1839-1845

67?Lee M S， Yang D， Cheng C， Liang Y， Yang L， Cheng F. J. Chromatogr. A.， 2003， ?985（1?2）： 387-394

68?Qian J， Wu Y， Yang H， Michael A C. Anal. Chem.， 1999， ?71（20）： 4486-4492

69?LYU Yang， ZHANG Ya?Wen， TAN Lei， JI Wen?Liang， YU Ping， MAO Lan?Qun， ZHOU Fang. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， ?45（11）： 1595-1599

呂 揚(yáng)， 張雅文， 譚 磊， 紀(jì)文亮， 于 萍， 毛蘭群， 周 方. 分析化學(xué)， 2017， ?45（11）： 1595-1599

70?Liu K， Lin Y， Xiang L， Yu P， Su L， Mao L. Neurochem. Int.， 2008， ?52（6）： 1247-1255

71?Liu K， Lin Y， Yu P， Mao L. Brain Res.， 2009， ?1253： 161-168

72?Dalbasti T， Cagli S， Kilinc E， Oktar N， Ozsoz M. Nitric Oxide?Biol. Chem.， 2002， ?7（4）： 301-305

73?ZHANG Feng， GAO Dan， LIANG Qiong?Lin. Chinese J. Anal. Chem. 2016， ?44（12）： 1942-1949

張 逢， 高 丹， 梁瓊麟. 分析化學(xué)， 2016， ?44（12）： 1942-1949

74?Wang S， Liu X， Zhang M. Anal. Chem.， 2017， ?89（10）： 5382-5388

75?Lin Y， Lu X， Gao X， Cheng H， Ohsaka T， Mao L. Electroanalysis， 2013， ?25（4）： 1010-1016

76?Marinov M B， Harbaugh K S， Hoopes P J， Pikus H J， Harbaugh R E. J. Neurosurg， 1996， ?85（1）： 117-124

77?Gao X， Yu P， Wang Y， Ohsaka T， Ye J， Mao L. Anal. Chem.， 2013， ?85（15）： 7599-7605

78?Lin Y， Yu P， Hao J， Wang Y， Ohsaka T， Mao L. Anal. Chem.， 2014， ?86（8）： 3895-3901

79?ZHAO Fan， SHI Guo?Yue， TIAN Yang. Chinese J. Anal. Chem. 2019， ?47（3）： 347-354

趙 凡， 施國(guó)躍， 田 陽(yáng). 分析化學(xué)， 2019， ?47（3）： 347-354

80?WANG Qian?Qian， ZHANG Yan， MENG Lu?Lu， PI Zi?Feng， LIU Shu， SONG Feng?Rui， LIU Zhi?Qiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， ?43（11）： 1754-1760

王倩倩， 張 艷， 孟璐璐， 皮子鳳， 劉 舒， 宋鳳瑞， 劉志強(qiáng). 分析化學(xué)， 2015， ?43（11）： 1754-1760

81?Li X， Dunevall J， Ewing A G. Angew. Chem. Int. Edit.， 2016， ?55（31）： 9041-9044

82?Li X， Majdi S， Dunevall J， Fathali H， Ewing A G. Angew. Chem. Int. Edit.， 2015， ?54（41）： 11978-11982

83?Ren L， Pour M D， Majdi S， Li X， Malmberg P， Ewing A G. Angew. Chem. Int. Edit.， 2017， ?56（18）： 4970-4975

Recent Advances on in Vivo Electrochemical

Analysis of Vitamin C In Rat Brain

JI Wen?Liang1， ZHANG Mei?Ning*1， MAO Lan?Qun*2，3

1（Department of Chemistry， Renmin University of China， Beijing 100872， China）

2（Beijing National Laboratory for Molecular Science， Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems，

Institute of Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China）

3（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

Abstract?Vitamin C， also known as ascorbic acid， is an important neurochemicals in the brain. It serves as one of most important small?molecular?weight antioxidants for neuro?protection and neuromodulator to modulate neurological functions through glutamatergic， dopaminergic and neurotransmission. It is also a cofactor of enzymes involved in biosynthetic reactions such as the synthesis of catecholamines. Therefore， increasing interest has attracted in the measurement of AA in the brain. The high?potential oxidation of AA essentially renders difficulties in exploring the electrochemical property of AA to constitute an electrochemical protocol for its selective detection of AA with high spatial and temporal resolution in the brain. This review mainly focuses on recent updates on detection of AA by modulating the electron transfer of AA to achieve the high temporal， spatial resolution and selectivity for its detection in the rat brain and single?cell.

Keywords?Vitamin C; In vivo; Electrochemical analysis; Selectivity; Review