陳綺映，林超，楊榮豐，黃榮，王麗麗*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院深圳醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 深圳 518000； 2.中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院兒科，廣東 深圳 518000)

內(nèi)皮細(xì)胞的功能損傷、死亡，被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化 ( AS) 發(fā)病的早期關(guān)鍵性環(huán)節(jié)[1]。內(nèi)皮細(xì)胞的死亡方式有兩種，凋亡和壞死。動(dòng)脈粥樣硬化的各種致病因素如：吸煙、肥胖、高血壓、高血糖、高血脂等均可引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。近年來(lái)的許多研究也已經(jīng)證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是AS病變的主要特征之一，并在AS的形成和發(fā)展中起了重要的作用[2，3]。

近年來(lái)關(guān)于腸道菌群與疾病的相關(guān)性研究不斷涌現(xiàn)，腸道菌群在人類健康中的作用也越來(lái)越得到人們關(guān)注。隨著對(duì)腸道菌群研究的逐步深入，發(fā)現(xiàn)腸道菌群及其代謝產(chǎn)物TMAO可能通過(guò)促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展，成為心血管疾病的又一危險(xiǎn)因素[4，5]。然而目前，關(guān)于TMAO與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究較少，TMAO促進(jìn)AS的發(fā)生，是否與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)，目前尚未得知。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的人參皂苷單體眾多，其中人參皂苷Rh1是備受關(guān)注的單體之一。研究表現(xiàn)人參皂苷Rh1可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞活性[6]。然而人參皂苷Rh1究竟是通過(guò)什么方式發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，目前仍未定論。與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh1可抑制乳腺癌細(xì)胞的凋亡[7]。然而，目前尚未有關(guān)于人參皂苷Rh1與內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的研究。本研究以 TMAO誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡為模型，探討人參皂苷的保護(hù)作用，為保護(hù)血管內(nèi)皮功能和防治開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料,試劑與主要儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院提供，TMAO購(gòu)于Sigma公司，人參皂苷Rh1購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司，EDU細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)于銳博生物科技公司，Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司，ECM培養(yǎng)基購(gòu)于北京裕恒豐科技有限公司，其配套的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子胎牛血清購(gòu)于Invitrogen-Gibco公司，DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco 公司，流式細(xì)胞檢測(cè)采用B D的FACSVerse流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞熒光的檢測(cè)采用日本的olympus顯微鏡，Caspase-3抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 EDU增殖實(shí)驗(yàn)

內(nèi)皮細(xì)胞的增殖采用EDU增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。內(nèi)皮細(xì)胞消化后，按照4 ×103個(gè)/孔的細(xì)胞量傳到96孔板中。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、TMAO組、人參皂苷Rh1組、TMAO+人參皂苷Rh1組。TMAO組加入100 μmol/L的TMAO{GuoHua Ma}，人參皂苷Rh1組加入200 μmol/L的人參皂苷Rh1( Wonhwa Lee，)，TMAO+人參皂苷Rh1組在加入100 μmol/L的TMAO的同時(shí)加入的200 μmol/L人參皂苷Rh1。細(xì)胞貼壁后加入刺激因素，處理24 h，加入EDU染色反應(yīng)液。繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞1～2次，每次5min。每孔加入4%的多聚甲醛固定30min，之后用2 mg/ml甘氨酸脫色搖床孵育5 min。PBS清洗3次后，加入0.5 %TritonX-100的PBS，脫色搖床孵育10 min。各組加入EDU染色反應(yīng)液，避光，室溫脫色搖床孵育30 min。用含0.5 % TritonX-100的PBS清洗3次后，進(jìn)行DAPI染色封片。之后在熒光顯微鏡下面觀察 細(xì)胞增殖的狀態(tài)。

1.3 流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞分組同前,內(nèi)皮細(xì)胞在加入刺激因素后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后用胰酶消化后，1 000 轉(zhuǎn)離心5 min。棄上清，每組加入195ul Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。之后加入5ul Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min后，離心，棄上清。加入1905ul Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，最后加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)。

1.4 Western-blot實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞分組同前，內(nèi)皮細(xì)胞在加入刺激因素后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后用胰酶消化收集細(xì)胞。細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，收集蛋白。凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜后加入caspase-3的一抗，37 ℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗，孵育2 h，0.01 mol/L PBS洗膜，5 min×4次。加入顯色液,避光顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rh1降低TMAO對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖的抑制作用

如圖1顯示，相對(duì)于對(duì)照組，TMAO可以顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖(P<0.05)。單獨(dú)的人參皂苷Rh1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖沒有顯著的影響，但是人參皂苷Rh1的加入可以扭轉(zhuǎn)TMAO對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖的抑制作用，相對(duì)于TMAO組增殖率明顯升高(P<0.05)，見圖1。

合成DAPIEDU對(duì)照RhqTMAOTMAO+Rh1

圖1 人參皂苷Rh1削弱TMAO對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制的作用

2.2 人參皂苷Rh1抑制TMAO上調(diào)的HUVECs凋亡相關(guān)基因caspase-3的蛋白表達(dá)

如圖2所示，Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TMAO可以上調(diào)HUVECs凋亡相關(guān)基因caspase-3的蛋白表達(dá)(P<0.05)。當(dāng)加入人參皂苷Rh1后，可以發(fā)現(xiàn)這種上調(diào)作用受到了抑制(P<0.05)。

2.3 人參皂苷Rh1對(duì)TMAO誘導(dǎo)的HUVECs凋亡起保護(hù)作用

流式細(xì)胞檢測(cè)的結(jié)果顯示TMAO可以誘導(dǎo)HUVECs凋亡，凋亡細(xì)胞的比例明顯增加 (P<0.01)。單獨(dú)人參皂苷Rh1對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡沒有顯著的影響，但是可以抑制TMAO引起的內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡 ，凋亡的細(xì)胞數(shù)相對(duì)于TMAO組明顯降低(P<0.01)。見 圖3。

1234Caspase-3GAPDH

圖2 人參皂苷Rh1削弱TMAO上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)的作用

TMAO+Rh1TMAORh1對(duì)照組

圖3 人參皂苷Rh1削弱TMAO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性的、多種致病因素作用下誘發(fā)的血管疾病，是發(fā)展中國(guó)家心血管事件死亡的主要原因。內(nèi)皮損傷及功能紊亂被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化的始動(dòng)環(huán)節(jié)[8]。研究發(fā)現(xiàn)，凋亡內(nèi)皮細(xì)胞可導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，并誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂和血栓形成，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有著重要的意義[9-10]。因此，尋找新的延緩內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的生物因子或機(jī)制，可為防治動(dòng)脈粥樣硬化提供新的靶點(diǎn)。

腸道菌群與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的關(guān)系研究，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。TMAO作為腸道菌群在人體的主要代謝產(chǎn)物，已被證明與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[11-12]。 我們的研究發(fā)現(xiàn)，TMAO干預(yù)的HUVECs出現(xiàn)細(xì)胞增殖下降、凋亡上調(diào)的情況，再次驗(yàn)證了TMAO誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。

人參皂苷是傳統(tǒng)中藥人參中的主要有效成分，被證實(shí)有多種生理作用。截至目前，已有超過(guò)40種人參皂苷單體從人參中分離提取出來(lái)，其中含量較高主要有Rb1、Rg1、Rh1等。其中，人參皂苷Rh1可發(fā)揮廣泛的生理效應(yīng)，如：抗炎、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)、內(nèi)皮保護(hù)等。我們的研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh1可對(duì)抗TMAO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。這就提示，人參皂苷Rh1可能通過(guò)對(duì)抗TMAO誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用。然而，人參皂苷Rh1的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用的具體機(jī)制，尚有待進(jìn)一步研究。我們會(huì)在后續(xù)的研究中，從分子機(jī)制的層面展開探究，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面上驗(yàn)證。本研究為此提供了思路。

綜上所述，我們的研究表明，人參皂苷Rh1可對(duì)抗TMAO誘導(dǎo)的HUVECs凋亡，繼而發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用。