帥永鑫，陳凌通，葉春林

(1.杭州珍鑫源食品有限公司，浙江 杭州 311300；2.浙江甌華化工進出口有限公司，浙江 臺州 318000；3.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點實驗室，浙江 杭州 310023)

野薔薇根為薔薇科植物野薔薇RosamultifloraThunb的干燥根，最早收載于《名醫(yī)別錄》，具有一定的健脾理氣、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、助消化等作用，廣泛用于治療胃功能失調(diào)、慢性氣管炎、腸炎等多種疾病。野薔薇根提取物的制劑，經(jīng)藥理和臨床試驗有明顯降血脂的作用[1]。野薔薇根中含有多種有效成分，如多酚、鞣質(zhì)、皂苷、多糖等[2，3]。研究表明，多糖具有增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗輻射、抗氧化、抗病毒、降血脂、抑菌等作用[4-7]。

本研究以野薔薇根多糖提取率為指標(biāo)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交實驗法優(yōu)化其提取工藝；采用三氯乙酸法除去多糖中的蛋白質(zhì)，對野薔薇根多糖進行了初步純化；通過紅外檢測初步分析了野薔薇根多糖的結(jié)構(gòu)；為野薔薇根的深加工及增加附加值提供了理論依據(jù)，具有一定的理論意義和實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗材料 野薔薇根購于杭州市西湖區(qū)藥房；葡萄糖、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、三氯乙酸、氫氧化鈉購于上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.1.2 實驗儀器 BS2202S精密天平(SARTORIUS公司)；752紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；DKS-24型電熱恒溫水浴鍋(杭州藍天化驗儀器廠)；GZX-9070 MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司)；DZF-6020MBE真空干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司)；TGL-16G-A高速冷凍離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)；VERTEX 70紅外光譜儀(德國BRUKER公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 提取液中的多糖含量測定采用苯酚硫酸法。參考文獻[8]，求得吸光度(Y)與多糖質(zhì)量濃度(Y，mg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=39.809 52x-0.012 86，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 1。再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出多糖物質(zhì)質(zhì)量濃度。

按回歸方程計算，多糖提取率的計算公式：

在這個算式中：C為野薔薇根提取液多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為提取用野薔薇根的質(zhì)量，mg。

1.2.2 原料預(yù)處理 取野薔薇根，洗凈，60 ℃烘箱干燥至恒重，粉碎過60目篩，收集篩下物，置于圓底燒瓶中，采用無水乙醇，回流2 h，脫去表面脂肪，抽濾，60 ℃鼓風(fēng)干燥待用。

1.2.3 野薔薇根多糖提取的單因素實驗 提取時間考察：精確稱取5份2 g經(jīng)預(yù)處理的野薔薇根粉于三口燒瓶中，分別加入蒸餾水各50 mL，在80 ℃恒溫水浴鍋中分別冷凝回流提取30、45、60、75、90 mim，實驗結(jié)束時加入同溫度的蒸餾水至原體積。趁熱過濾，冷卻后分別取2 mL提取液，置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至10 mL。在490 nm紫外分光光度計下測定吸光度，計算多糖提取率。比較不同提取時間的野薔薇根多糖提取率，以確定提取時間較優(yōu)取值。

提取溫度考察：精確稱取5份2 g經(jīng)預(yù)處理的野薔薇根粉于三口燒瓶中，分別加入蒸餾水各50 mL，分別在60、70、80、90、100 ℃恒溫水浴鍋中冷凝回流提取60 min，實驗結(jié)束時加入同溫度的蒸餾水至原體積。趁熱過濾，冷卻后分別取2 mL提取液，置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至10 mL。在490 nm紫外分光光度計下測定吸光度，計算多糖提取率。比較不同提取溫度下，野薔薇根多糖的提取率，確定提取溫度較優(yōu)取值。

料液比考察：精確稱取5份2 g經(jīng)預(yù)處理的野薔薇根粉于三口燒瓶中，分別加入蒸餾水各40、50、60、70、80 mL，在80 ℃恒溫水浴鍋中冷凝回流提取60 min，實驗結(jié)束時加入同溫度的蒸餾水至原體積。趁熱過濾，冷卻后分別取2 mL提取液，置于10 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至10 mL。在490 nm紫外分光光度計下測定吸光度，計算多糖提取率。比較各料液比下野薔薇根多糖提取率，以確定料液比較優(yōu)取值。

1.2.4 野薔薇根多糖提取的正交實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上，采用L9(33)正交實驗，對提取時間、提取溫度和料液比三因素的條件進行優(yōu)化，方案設(shè)計如表1所示。

表1 正交實驗因素與水平

1.2.5 野薔薇根多糖的初步純化和紅外吸收光譜分析 將按上述“1.2.3”和“1.2.4”項下提取得到的多糖溶液在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮，在濃縮后的多糖溶液中加入4倍體積的無水乙醇，靜置1天，然后經(jīng)1 000 rpm離心，收集沉淀，得粗多糖。

將粗多糖用去離子水復(fù)溶，加入等體積質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的三氯乙酸溶液，振蕩30 min，靜置70 min。1 000 rpm離心10 min，棄去沉淀，上清液用NaOH溶液中和，將清液在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中濃縮至小體積[9]，加入4倍體積的無水乙醇，放置在4℃冰箱過夜，然后經(jīng)1 000 rpm離心，收集沉淀，經(jīng)真空干燥得到野薔薇根初步精制的多糖。

稱取經(jīng)初步精制的野薔薇根多糖2 mg，做KBr壓片，用FTIR測定多糖在4 000～400 cm-1的吸收峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 提取時間對野薔薇根多糖提取率的影響 提取時間對野薔薇根多糖提取率的影響見圖1。

圖1 提取時間對多糖提取率的影響

由圖1可見，隨著提取時間的延長，多糖提取率增大，當(dāng)提取時間到達60 min時，多糖提取率達到最大，再繼續(xù)增加時間，多糖提取率反而下降。其原因可能是提取時間太短，多糖與蛋白質(zhì)、多酚等結(jié)合物不能較好地分離，提取率較低；提取時間過長，部分多糖結(jié)構(gòu)受到破壞，從而降低了提取率。故提取時間選擇60 min為0水平，進行正交優(yōu)化。

2.1.2 提取溫度對野薔薇根多糖提取率的影響 提取溫度對野薔薇根多糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖2可見，多糖提取率隨提取溫度的升高而顯著變化，變化趨勢為先增大后減小，當(dāng)溫度在80 ℃時提取率最大。這可能是起始升高溫度有利于總多糖的擴散、溶出，故提取率增大，而當(dāng)溫度過高時，可能出現(xiàn)多糖受熱分解，或雜質(zhì)溶解度增大等，導(dǎo)致提取率減小。故提取溫度選擇80 ℃為0水平，進行正交優(yōu)化。

2.1.3 料液比對野薔薇根多糖提取率的影響 料液比對野薔薇根多糖提取量的影響見圖3。

圖3 料液比對總多糖提取率的影響

由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，藥材的多糖提取量隨料液比的增大而增大，但料液比增大到一定程度后，多糖提取量逐漸趨于飽和。野薔薇根在料液比為1∶30(g/mL)時多糖提取量達到最大，故料液比選擇1∶30為0水平，進行正交優(yōu)化。

2.2 正交實驗及結(jié)果分析

實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗因素水平與結(jié)果

由表2中極差R值可知，影響野薔薇根多糖提取率的因素按影響程度大小排序為：B>A>C，即浸提溫度>浸提時間>料液比。

2.3 驗證實驗

經(jīng)極差分析可知，當(dāng)組合為A2B3C3，即浸提時間為60 min，浸提溫度為90 ℃，料液比為1∶30時，野薔薇根多糖得率達到最大。按此工藝條件進行三次平行驗證實驗，得出最優(yōu)組合提取條件下的多糖得率為(0.561±0.023)%。

2.4 紅外光譜分析結(jié)果

紅外光譜分析結(jié)果見圖4。

圖4 野薔薇根多糖的紅外吸收光譜

由圖4可知：3 430 cm-1附近為-OH 基伸縮振動的寬吸收峰，表明野薔薇根多糖具有分子間與分子內(nèi)的氫鍵。2 924 cm-1為CH3、CH2、CH等的C-H 伸縮振動，此處為糖的特征吸收峰[10]。在1 633 cm-1處的吸收峰為游離的羧酸或羧酸鹽(-COO)C=O 的非對稱伸縮振動，同時也是糖的水化物樣品的吸收峰[11]。1 451 cm-1附近的吸收峰是C-H的變角振動峰，1 031 cm-1、1 079 cm-1是吡喃糖環(huán)羥基的變角振動所產(chǎn)生，說明糖環(huán)結(jié)構(gòu)中含有吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。900 cm-1以下的指紋區(qū)還存在較多密集而復(fù)雜的吸收峰，許多峰難以歸屬，但可以反映具體化合物結(jié)構(gòu)上的微小差別。

3 結(jié)語

本研究采用水提取法從野薔薇根中提取多糖，考察了提取時間、提取溫度和料液比等3個因素對野薔薇根多糖得率的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，進行了正交實驗，得出野薔薇根多糖提取的最優(yōu)條件為提取時間60 min，實驗溫度為90 ℃，水料比為1∶30時，野薔薇根多糖得率達到最大即(0.561±0.023)%。采用三氯乙酸法除去多糖中的蛋白質(zhì)，醇沉法分離獲得多糖，對野薔薇根多糖進行了初步純化。通過紅外檢測初步分析了野薔薇根多糖的結(jié)構(gòu)，包括野薔薇根多糖中各種顯著的官能團。利用熱水浸提法提取野薔薇根多糖的方法，實驗步驟少，操作簡單，經(jīng)濟高效，可為熱水法提取野薔薇根多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。