王云翔，尹玉偉，尹玉林，程 義，秦 悅，王 楠，李月紅

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130118)

鎘(Cadmium, Cd)是一種對動植物危害巨大的重金屬，被廣泛的應(yīng)用于電池、電鍍、顏料等眾多制造環(huán)節(jié)。鎘是生命過程的非必需元素，因此鎘進(jìn)入動植物機(jī)體后會造成嚴(yán)重的損傷[1]。我國《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》(GB11607-89)規(guī)定水中鎘濃度需低于0.005 mg/L[2]。

鎘中毒的治療主要是通過使用螯合劑，而螯合劑較大的副作用，使其使用受到較大的限制[3]。益生菌具有較高的抗逆性以及重金屬耐受性，其對動物重金屬中毒有一定緩解作用[4]。研究表明，乳酸菌具有較好的耐重金屬(主要是鎘和鉛)作用，同時對于動物的急性或慢性鎘中毒都能夠有一定緩解作用[5-6]。枯草芽孢桿菌被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖中，而其對于重金屬減毒作用研究較少，對于鎘毒性緩解作用研究更少。本試驗(yàn)將枯草芽孢桿菌和不同劑量的鎘分別加入飼料和水中暴露鯽魚，測定組織中鎘濃度及抗氧化指標(biāo)，為枯草芽孢桿菌減鎘毒性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康鯽魚300條，平均體重55 g±0.74 g，由新立城水庫提供。試驗(yàn)前置于80 L玻璃缸中適應(yīng)7 d。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑 氯化鎘(CdCl2·2.5 H2O )、高氯酸、硝酸和氯化鈉，購自北京化工廠； 瓊脂、酵母提取物和胰蛋白胨，購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)和谷胱甘肽(GSH)試劑盒，均購自南京建成生物有限公司。

1.2.2 主要儀器 全波長酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技有限公司；火焰原子吸收分光光度計，日本島津公司；低溫高速離心機(jī)，貝克曼庫爾特公司。

1.2.3 鎘溶液的配制 鎘母液配制：稱取20.31 g氯化鎘，充分溶于1 L的蒸餾水中，轉(zhuǎn)至玻璃瓶中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)設(shè)計

1.3.1 枯草芽孢桿菌耐鎘試驗(yàn) 配制含有梯度鎘(100 mg/L～700 mg/L)的LB培養(yǎng)板，將枯草芽孢桿菌涂于培養(yǎng)板上，進(jìn)行最大耐鎘濃度測定。將6.4×109CFU/mL的液體LB稀釋后涂于梯度鎘板上，培養(yǎng)12 h觀察枯草芽孢桿菌的生長情況。

1.3.2 動物試驗(yàn) 經(jīng)適應(yīng)7 d的鯽魚，隨機(jī)分成6組，對照組(C0S0)，枯草芽孢桿菌組(C0S1)：飼料中只添加108CFU/g的枯草芽孢桿菌；低濃度鎘組(C1S0)：在水中只添加0.5 mg/L的鎘；枯草芽孢桿菌治療1組(C1S1)：飼料中添加108CFU/g的枯草芽孢桿菌和在水中添加0.5 mg/L的鎘；高濃度鎘組(C2S1)：在水中只添加1 mg/L的鎘；枯草芽孢桿菌治療2組(C2S1)：飼料中添加108CFU/g的枯草芽孢桿菌和在水中添加1 mg/L的鎘。試驗(yàn)期間，每天9點(diǎn)和18點(diǎn)飼喂2次，飼喂量為魚體重的1%～2%，每缸水為80 L，每2 d換水1次，換水量為總體積的1/3，水溫維持在23 ℃±2 ℃，水中的溶氧為7.2 mg/L，試驗(yàn)周期為60 d。

1.4 測定指標(biāo)以及方法

1.4.1 樣品采集 試驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行組織樣品的采集，分別采取鯽魚的鰓、肝臟、胰臟、腸道、腎、脾臟和肌肉組織。采樣前先用麻醉劑將鯽魚進(jìn)行麻醉，放于冰袋上進(jìn)行解剖，采集后的組織用無菌生理鹽水進(jìn)行沖洗，濾紙吸干后放于-80 ℃保存。

1.4.2 組織鎘濃度測定 將采集的組織，用雙蒸水清洗，55 ℃烘干，稱取重量，加濃硝酸進(jìn)行酸解后使用高壓微波爐進(jìn)行消解，消解后定溶于20 mL的容量瓶中，使用火焰原子吸收分光光度計測定鎘濃度，最后計算組織中鎘濃度。

1.4.3 組織氧化指標(biāo)測定 準(zhǔn)確稱取組織的重量，將組織剪碎后加入一定量冰冷的生理鹽水，冰浴勻漿，3 000 r/min(4 ℃)離心10 min，取上清待用。SOD、GSH、GST各指標(biāo)按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS20.0軟件進(jìn)行處理，組間采用單因素方差分析，兩兩對比采用LSD分析，以P< 0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 枯草芽孢桿菌對鎘耐性結(jié)果 枯草芽孢桿菌對鎘耐性結(jié)果(圖1)，從結(jié)果中看出，隨著培養(yǎng)基中Cd濃度增加，枯草芽孢桿菌的菌落逐漸變小和變少，當(dāng)Cd濃度達(dá)到300 mg/L時，枯草芽孢桿菌不再生長。

圖1 枯草芽孢桿菌對鎘耐性結(jié)果

A：對照組；B：100 mg/L鎘；C：200 mg/L鎘；D：300 mg/L鎘

2.2 組織中鎘濃度測定 由表1可知，組織中鎘濃度量大小依次是：鰓>腎>腸>肝>肌肉；同劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟、腎、腸和鰓組織中鎘含量顯著降低(P<0.05)；肌肉組織鎘濃度，高濃度鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組差異顯著(P<0.05)。

表1 鯽魚各組織鎘含量

注：同一列數(shù)據(jù)中，肩標(biāo)有不同字母者表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)有相同字母的表示差異不顯著(P>0.05)

2.3 肝臟抗氧化指標(biāo)測定

2.3.1 肝臟SOD指標(biāo) 由圖2可知，同劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟SOD活性顯著升高(P<0.05)。

圖2 鯽魚肝臟中SOD變化

2.3.2 肝臟GSH指標(biāo) 由圖3可知，低劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟GSH活性顯著升高(P<0.05)；高劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟GSH活性差異不顯著(P>0.05)。

圖3 鯽魚肝臟中GSH變化

2.3.3 肝臟GST指標(biāo) 由圖4可知，同劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟GST活性顯著降低(P<0.05)。

圖4 鯽魚肝臟中GST變化

3 討論

枯草芽孢桿菌能夠提高畜禽的飼料轉(zhuǎn)化率，改善宿主腸道微生態(tài)平衡，提高免疫力，被廣泛的應(yīng)用于畜牧水產(chǎn)中。此外，其還有具有較高的抗逆性，在處理水環(huán)境中也具有很廣泛的應(yīng)用，程靜等研究發(fā)現(xiàn)，在水體中枯草芽孢桿菌對鎘最大的耐受為50 mg/L,同時其對水體中的鎘具有較高的吸附去除作用[7]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌的最大耐鎘濃度在200 mg/L～300 mg/L之間，可能是由于本文所用的菌為鯽魚養(yǎng)殖池底泥中分離，對鎘有較高的耐受性。

鎘進(jìn)入機(jī)體后，能夠與鐵、鋅等元素競爭細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致抗氧化功能的損傷[8]；同時還會破壞硫醇氧化還原平衡，從而導(dǎo)致細(xì)胞谷胱甘肽含量降低[9]；上述機(jī)制會誘導(dǎo)氧活性自由基(ROS)的過量產(chǎn)生，引起機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)[10-11]。此外，鎘還能夠顯著刺激金屬硫蛋白(MT)的表達(dá)，當(dāng)水生動物暴露重金屬后，MT基因在不同組織中的表達(dá)與重金屬的暴露存在顯著的相關(guān)性，也因而被用來作為生物標(biāo)記物來檢測水環(huán)境中重金屬的污染[12-13]。Kim等通過利用維生素C和鉛同時暴露許氏平鲇后發(fā)現(xiàn)，維生素C能夠減少鉛的積累，而組織中的鉛濃度依次為：腎>肝>脾 >腸>鰓>肌肉。本試驗(yàn)中，組織中鎘濃度依次為：鰓>腎>腸>肝>肌肉，這與攻毒方式有關(guān)[14-15]，本試驗(yàn)的攻毒方式為將鎘加入水中，而Kim是將鉛加入飼料中，枯草芽孢桿菌對鎘有一定的耐受性，同劑量鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組對比，肝臟、腎、腸和鰓組織中鎘含量顯著降低(P<0.05)；肌肉組織鎘濃度，高濃度鎘暴露組與枯草芽孢桿菌治療組差異顯著(P<0.05)，這可能與枯草芽孢桿菌在鯽魚腸道內(nèi)對鎘進(jìn)行吸附，從而降低了腸道內(nèi)的鎘濃度，進(jìn)而減少了對鎘的吸收有關(guān)，也可能與枯草芽孢桿菌調(diào)節(jié)了MT基因的表達(dá)有關(guān)，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。組織中鎘濃度降低，有利于機(jī)體正常代謝的進(jìn)行，因此，抗氧化指標(biāo)得到了一定的提升，同時枯草芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物能夠進(jìn)入機(jī)體，對抗氧化能力也有一定的提升作用。

綜上所述，枯草芽孢桿菌具有較高的耐鎘能力，同時能夠促進(jìn)鎘暴露鯽魚后組織中鎘的代謝速度，此外，對于鎘暴露的氧化應(yīng)激有一定的修復(fù)作用。