嚴(yán)笑　歐陽(yáng)桂芳　徐凱紅　胡麗慶

[摘要] 目的 探討多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）患者血清miRNA-181a（miR-181a）水平與病理特征的關(guān)系。方法 選取2013年4月～2015年4月我院收治的MM患者50例作為MM組，收集患者的病理特征資料，包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、首診癥狀、骨髓瘤骨?。╩yeloma bone disease，MBD）分級(jí)、國(guó)際分期系統(tǒng)（international staging system，ISS）分期、體力狀況評(píng)分[采用美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)]、分型以及血清miRNA-181a水平。選取同期于我院體檢的體檢者50例作為體檢組，比較兩組血清miRNA-181a水平，采用受試者工作特征曲線(xiàn)（receiver operating characteristic，ROC）分析血清miRNA-181a對(duì)MM的預(yù)測(cè)價(jià)值。利用Spearman檢驗(yàn)分析血清miRNA-181a與病理特征的關(guān)系。 結(jié)果 MM組血清miR-181a水平高于體檢組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。血清miR-181a預(yù)測(cè)MM的曲線(xiàn)下面積為0.668（標(biāo)準(zhǔn)誤=0.053，P=0.004，95%CI=0.563～0.772）。血清miRNA-181a低表達(dá)者的骨病A級(jí)、ISSⅠ期占比分別為58.33%、58.33%，高于miRNA-181a高表達(dá)者的10.53%、7.89%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Spearman檢驗(yàn)提示血清miRNA-181a表達(dá)水平與MM患者的骨病MBD分級(jí)、ISS分期呈正相關(guān)（P<0.05）。 結(jié)論 與健康體檢者相比，MM患者的血清miRNA-181a水平明顯增高，且與骨病MBD分級(jí)、ISS分期有相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞] 多發(fā)性骨髓瘤;病理特征;miRNA-181a;相關(guān)性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R733.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）22-0009-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between serum miRNA-181a（miR-181a） level and pathological features in patients with multiple myeloma（MM）. Methods 50 patients with MM admitted to our hospital from April 2013 to April 2015 were selected as the MM group. The pathological characteristics of the patients were collected， including gender， age， body mass index， first diagnosis， myeloma bone disease（MBD） grading， international staging system（ISS） staging， physical status score[using Eastern Cooperative Oncology Group（ECOG）scoring criteria]， typing， and serum miRNA-181a levels. 50 patients with physical examination in our hospital were selected as the physical examination group. Serum miRNA-181a levels were compared between the two groups. The receiver operating characteristic（ROC） was used to analyze the predictive value of serum miRNA-181a for MM. The relationship between serum miRNA-181a and pathological features was analyzed by Spearman test. Results The serum miR-181a level in the MM group was higher than that in the physical examination group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The area under the curve of serum miR-181a predicted MM was 0.668（standard error=0.053，P=0.004，95%CI=0.563-0.772）. The percentages of bone disease grade A and ISS stage Ⅰ in low expression of miRNA-181a patients were 58.33% and 58.33%， respectively，which were higher than those of miRNA-181a high expression patients（10.53%， and 7.89%）. The difference was statistically significant（P<0.05）. Spearman test showed that serum miRNA-181a expression level was positively correlated with MBD grade and ISS stage of MM patients（P<0.05）. Conclusion Compared with healthy subjects， serum miRNA-181a level is significantly higher in MM patients and it is correlated with MBD grading and ISS staging.

[Key words] Multiple myeloma;Pathological features;MiRNA-181a;Correlation

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）以中老年者居多，其是一種惡性漿細(xì)胞病，臨床癥狀包括貧血、反復(fù)感染、高鈣血癥、廣泛性骨質(zhì)破壞等[1]。研究表明MM在西方國(guó)家血液惡性瘤中占比約為10%，發(fā)病率、死亡率均較高[2]。目前，臨床針對(duì)MM的治療已提出了多種方式，然而，治療效果并不理想，復(fù)發(fā)率高，且易出現(xiàn)耐藥性，對(duì)患者預(yù)后影響非常大[3-4]。因此，臨床必須尋求新的治療方向，便于進(jìn)一步改善預(yù)后。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)部分微小RNA（miRNA）在惡性瘤中呈異常表達(dá)，如miRNA-181a（miR-181a）作為miR-181家族的重要成員，可能與自身免疫疾病、惡性瘤進(jìn)展密切相關(guān)[5]。本次研究旨在分析MM患者血清miR-181a水平與病理特征的關(guān)系，便于為該病診療提供依據(jù)，提出更具針對(duì)性的治療策略，改善預(yù)后，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年4月～2015年4月我院收治的MM患者50例作為MM組，選取同期于我院體檢的體檢者50例作為體檢組。MM組男27例，女23例，年齡40～76歲，平均（64.32±10.48）歲;體質(zhì)指數(shù)18～26 kg/m2，平均（22.53±2.12）kg/m2;骨髓瘤骨病（myeloma bone disease，MBD）分級(jí)：A級(jí)11例、B級(jí)23例、C級(jí)12例、D級(jí)4例;類(lèi)型：IgA型14例、IgG型23例、輕鏈型9例、其他4例;首診癥狀：貧血12例、骨痛28例、球蛋白增高7例、其他3例;ISS分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期26例、Ⅲ期14例;體力狀況評(píng)分[采用美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組（Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)]：<2分41例，≥2分9例。體檢組男24例，女26例，年齡37～75歲，平均（62.89±12.16）歲;體質(zhì)指數(shù)18～26 kg/m2，平均（22.49±2.08）kg/m2。研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)通過(guò)，兩組性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）MM組：①符合《中國(guó)多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2011年修訂）》[6]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床診斷明確;②入院前無(wú)抗骨髓瘤治療史;③無(wú)凝血功能障礙;④精神、認(rèn)知功能正常;⑤知情同意。（2）體檢組：①無(wú)血液系統(tǒng)疾病;②無(wú)惡性腫瘤;③機(jī)體狀態(tài)良好;④性別、年齡、體質(zhì)量與MM組匹配;⑤知情同意。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)? （1）無(wú)白血病等其他血液疾病;（2）肝、腎、腦等臟器嚴(yán)重?fù)p害;（3）血清標(biāo)本不合格;（4）臨床資料不完整。

1.3 檢測(cè)方法

主要儀器包括定量PCR儀（美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)T100型）、全自動(dòng)生化分析儀（貝克曼庫(kù)爾特公司AU5800系列）、電泳分析儀（美國(guó)bio-rad|Biorad）。主要試劑包括miRNA提取試劑盒（上海恪敏生物科技有限公司）、乳酸脫氫酶（上海索寶生物科技有限公司）、引物（上海賽信通生物試劑有限公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海賽信通生物試劑有限公司）。所有受檢者均于入院當(dāng)日采集5 mL血液標(biāo)本，利用離心機(jī)離心5 min（3500 r/min），分離血清，置于EP管內(nèi)，存放于-80℃冰箱。參考試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)血清miRNA進(jìn)行提取，以U6為內(nèi)參。經(jīng)PCR擴(kuò)增儀擴(kuò)增，miR-181a上、下游引物分別如下：5-AACATTCAACGCTGTCGGTGAGT-3、5-GTGCAG-GGTCCGAGGT-3，U6上、下游引物分別如下：5-CGCTTCGGCAGCACATATA-3、5-TTCACGAATT-TGCGTGTCAT-3。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min，94℃ 20 s，60℃ 40 s，循環(huán)45次，按照2-△Ct計(jì)算miR-181a相對(duì)定量。

1.4 觀(guān)察指標(biāo)

比較MM組、體檢組的血清miR-181a水平，利用受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC）分析血清miRNA-181a對(duì)MM的預(yù)測(cè)價(jià)值。并收集MM患者的臨床資料，包括性別、年齡、腎功能不全、首診癥狀、骨病MBD分級(jí)、ISS分期、體力狀況評(píng)分（ECOG）、分型、血清miRNA-181a水平，利用Spearman檢驗(yàn)分析血清miRNA-181a與病理特征的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

經(jīng)SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析臨床資料，計(jì)數(shù)資料用（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，經(jīng)ROC曲線(xiàn)血清miRNA-181a對(duì)MM的預(yù)測(cè)價(jià)值，采用Spearman檢驗(yàn)分析血清miRNA-181a與病理特征的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MM組、體檢組的血清miR-181a比較

MM組血清miR-181a水平為（0.005～0.595）-△Ct，平均（0.074±0.016）-△Ct。體檢組血清miR-181a水平為（0.001～0.012）-△Ct，平均（0.005±0.003）-△Ct。MM組血清miR-181a水平高于體檢組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 血清miR-181a對(duì)MM的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

通過(guò)繪制ROC曲線(xiàn)，發(fā)現(xiàn)血清miR-181a預(yù)測(cè)MM的曲線(xiàn)下面積為0.668（標(biāo)準(zhǔn)誤=0.053，P=0.004，95%CI=0.563～0.772），最佳截?cái)嘀禐?.071-△Ct，敏感度為62.70%，特異度為63.30%。ROC曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

2.3 MM患者血清miRNA-181a與病理特征的關(guān)系

以上述分析得出的miRNA-181a最佳截?cái)嘀禐榻纾瑢ⅰ?.071-△Ct作為高表達(dá)，<0.071-△Ct作為低表達(dá)。miRNA-181a低表達(dá)者的骨病A級(jí)、ISSⅠ期占比分別為58.33%、58.33%，高于miRNA-181a高表達(dá)者的10.53%、7.89%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.4 MM患者血清miRNA-181a與病理特征的相關(guān)性

采用Spearman檢驗(yàn)提示血清miRNA-181a表達(dá)水平與MM患者的骨病MBD分級(jí)、ISS分期呈正相關(guān)（P<0.05），與性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、類(lèi)型、首診癥狀、ECOG評(píng)分無(wú)明顯相關(guān)性（P>0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

MM的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，目前，臨床認(rèn)為MM惡性克隆主要與B細(xì)胞發(fā)育環(huán)境異常、遺傳學(xué)改變等因素相關(guān)，具體影響機(jī)制尚未徹底明確，還有待進(jìn)一步證實(shí)[7-8]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miRNA對(duì)細(xì)胞發(fā)育進(jìn)展影響較大，其可調(diào)控腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)其增殖或凋亡[9]?，F(xiàn)已有研究證實(shí)miRNA對(duì)多種惡性腫瘤有調(diào)控作用，如胰腺癌、肺癌等[10]。miR-181a與造血功能存在關(guān)聯(lián)，其參與了急性白血病的進(jìn)展，且與患者預(yù)后密切相關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)與體檢者相比，miR-181a在MM患者血清中的表達(dá)水平明顯增高，提示miR-181a可能參與了MM病情進(jìn)展。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-181a在MM細(xì)胞株以及骨髓中呈高表達(dá)，也表明miR-181a高表達(dá)與該病存在關(guān)聯(lián)[12]，為本研究提供了理論支持。

本研究通過(guò)繪制ROC曲線(xiàn)，發(fā)現(xiàn)血清miR-181a水平對(duì)MM具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，臨床可將其作為診斷MM的重要指標(biāo)。研究表明miR-181a可能具有致癌作用，P300/CBP作為其靶基因，在癌癥患者的大部分細(xì)胞株中存在表達(dá)丟失現(xiàn)象，miR-181a表達(dá)越高，則越有利于癌細(xì)胞株生長(zhǎng)[13-14]。另有研究提示miR-181a可能對(duì)凋亡蛋白有抑制作用，從而促使瘤體抗凋亡作用增強(qiáng)，但其具體機(jī)制尚未徹底明確，未來(lái)還需進(jìn)一步證實(shí)[15-16]。

本文發(fā)現(xiàn)miRNA-181a低表達(dá)者的骨病MBD分級(jí)以A級(jí)為主，ISS分期以Ⅰ期為主，而miRNA-181a高表達(dá)者骨病MBD分級(jí)以B級(jí)居多，ISS分期以Ⅱ期為主，最終經(jīng)Spearman檢驗(yàn)提示血清miRNA-181a水平與骨病MBD分級(jí)、ISS分期呈正相關(guān)。表明隨著骨病MBD分級(jí)、ISS分期越高，患者的血清miRNA-181a水平越高。骨病MBD分級(jí)已被認(rèn)為是影響MM患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，它能反映骨骼破壞程度，骨骼破壞程度越重，則局部炎癥越重，導(dǎo)致骨細(xì)胞更容易被吸收、溶解，骨細(xì)胞功能受到抑制[17]。ISS分期也是反映MM病情的重要指標(biāo)，對(duì)預(yù)后判斷有一定價(jià)值[18]。本研究提示血清miRNA-181a表達(dá)與二者呈正相關(guān)，這可能的原因在于miR-181可通過(guò)影響PI3K/Akt信號(hào)通路，繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，增加遷移風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致病情加重。

研究發(fā)現(xiàn)miR-181上調(diào)能提高U266細(xì)胞遷徙能力，而當(dāng)其下調(diào)時(shí)，則可抑制該細(xì)胞的遷徙能力，這提示靶向miR-181治療也許能促進(jìn)MM患者病情改善[19]。此外，MM治療效果與miRNA所致的耐藥機(jī)制相關(guān)，有研究提示腫瘤細(xì)胞耐藥與miR-181a表達(dá)水平存在關(guān)聯(lián)，通過(guò)下調(diào)miR-181a表達(dá)，能使細(xì)胞對(duì)治療藥物敏感性大大提升[20]。腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生與多種因素相關(guān)，尤其miRNA對(duì)耐藥細(xì)胞株的影響非常大，且已引起臨床重視，這為MM的治療提供了依據(jù)，在日后的醫(yī)學(xué)研究中可將其作為研究熱點(diǎn)，尋求靶向miR-181a治療方法，改善預(yù)后。

本研究的創(chuàng)新之處在于分析了血清miR-181a對(duì)MM的預(yù)測(cè)價(jià)值，明確了最佳截?cái)嘀?，并且探討了血清miR-181a與病理特征的相關(guān)性，有利于了解疾病特征，在未來(lái)提出更具針對(duì)性的治療策略。此外，本研究因受研究經(jīng)費(fèi)、病例納入時(shí)間等影響，導(dǎo)致樣本量少，未來(lái)還需擴(kuò)大樣本量，對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步證實(shí)。

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（收稿日期：2019-02-24）