李林 慕玉東（通訊作者） 賀林 張濤 袁志敏 代佳 秦浩 劉斯揚

（1陜西省腫瘤醫(yī)院 陜西 西安 710061）

（2西安市中心醫(yī)院 陜西 西安 710003）

近年來，伴隨著我國經濟迅速發(fā)展及工業(yè)化進程不斷加快，人口老齡化加劇，每年肺癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢，負擔日益加重。我國肺癌的發(fā)病率及死亡率已居所有惡性腫瘤之首，其中男性發(fā)病率和死亡率居第一位，女性的發(fā)病率居第二位，但其死亡率仍居第一位[1]。如何提高治療肺癌的效果以及肺癌的存活率，一直以來都是醫(yī)學界探討和研究的問題，中醫(yī)中藥在治療腫瘤方面成為了研究熱點。青藤堿（Sinomenine，SIN）是防己科植物青風藤的根和莖中的有效成分，具有抗炎、抗免疫、鎮(zhèn)咳、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、降血壓及治療心律失常的作用[2]，它還有抑制細胞周期引起腫瘤細胞的凋亡[3]，具有抗腫瘤的作用，但是青藤堿對小細胞肺癌是否有抑制作用仍不清楚。本研究觀察青藤堿對小細胞肺癌對NCI-H446的影響，并探討其機制，為小細胞肺癌的治療提供理論依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 細胞株與試劑

人小細胞肺癌細胞株NCI-H446（武漢博士德生物工程有限公司）；青藤堿(安賽邦醫(yī)藥科技有限公司)；5-FUR(批號：20101112，江蘇省南通市海爾斯藥業(yè))；F12K培養(yǎng)基（武漢博士德公司）；胎牛血清(FBS，美國Hyclone公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT，美國Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將NCI-H446細胞接種于含10%熱滅活新生小牛血清、1%雙抗（青霉素10KU/L和鏈霉素10mg/L）的F12K培養(yǎng)液中，置于37℃的細胞培養(yǎng)箱。細胞呈單層貼壁生長，實驗和傳代均取對數(shù)生長期細胞。

1.2.2 MTT實驗取對數(shù)生長的小細胞肺癌細胞NCI-H446，用含10%胎牛血清及1%雙抗（青霉素10KU/L和鏈霉素10mg/L）的F12K培養(yǎng)基調成1×105個/ml的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔200μL，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞貼壁后吸出培養(yǎng)基，加入100μL新鮮的基礎培養(yǎng)液與100μL不同濃度的青藤堿溶液（濃度分別為50、100、150、200、250μg/ml），每組設5個復孔。分別培養(yǎng)12、24、36h后，每孔加入MMT20μ L(5mg/ml)。再用酶標儀于490nm處測定吸光度值，計算藥物對NCI-H446的增殖抑制率，并計算半數(shù)抑制濃度（LC50）。細胞抑制率=（陰性對照組A490nm－實驗組A490nm）/陰性對照組A490nm×100%，重復3次。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期和細胞凋亡 調整細胞濃度25cm2培養(yǎng)瓶中(coming)，每瓶106個細胞，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，再于4℃培養(yǎng)2h，吸棄培養(yǎng)液并加入含青藤堿50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml、250μg/ml 不同濃度的培養(yǎng)基2.5ml，作用12h、24h、36h后收集細胞，經固定后采用流式細胞儀檢測細胞周期；Binding Buffer，Annex in v染色后檢測細胞凋亡率和死亡率,每組實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 SIN對NCI-H446細胞增殖的抑制作用

SIN濃度＜100μg/ml對NCI-H446細胞的增殖無明顯抑制。隨著SIN濃度的升高和培養(yǎng)時間的延長，其對細胞增殖的抑制明顯增強，有著顯著的時間－劑量效應關系（圖1）。SIN 250μg/ml培養(yǎng)36h，其抑制率最大為85.67%。

圖1 青藤堿不同濃度對NCI-H446細胞增殖的抑制

2.2 SIN對NCI-H446細胞凋亡的影響

流式細胞Annexin V/PI檢測細胞凋亡分析顯示，不同濃度的SIN培養(yǎng)36h，隨著SIN濃度的升高，早期凋亡和晚期凋亡的細胞比例都在逐漸增加，與對照組相比其差異具有顯著的統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2。

圖2 流式細胞術檢測細胞凋亡

3.討論

近年來，我國肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已經成為致死的主要惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類的健康。尤其小細胞肺癌，占肺癌的15%，其特征是倍增時間短，侵襲能力強，轉移早而廣泛，惡性程度高，預后差。大多數(shù)小細胞肺癌患者在診斷時已經是晚期，只能采取化療結合放療的治療方案，治療效果不理想，而且有著極大的副作用。因此，中醫(yī)中藥治療腫瘤成為了臨床上必要的選擇。已有研究證明青藤堿對肝癌、乳腺癌、宮頸癌等具有抗增殖、抗腫瘤的作用[4-7]，但青藤堿對小細胞肺癌是否有抑制作用研究較少。本實驗探討青藤堿的抗腫瘤作用，以小細胞肺癌細胞為研究對象，對其作用的機制進行研究。本實驗結果顯示青藤堿有顯著的促進人小細胞肺癌NCI-H446細胞凋亡，抑制細胞生長，而且隨著SIN濃度的升高和培養(yǎng)時間的延長，呈現(xiàn)了濃度依賴性和時間依賴性。

綜上，本實驗研究認為青藤堿對人小細胞肺癌NCI-H446細胞生長、增殖有明顯的抑制作用并促進其凋亡，作為中藥提取的有效成分，它具有較小的毒副作用及良好的抗腫瘤作用，在目前常規(guī)的放化療基礎上結合青藤堿中藥輔助治療，進一步提高小細胞肺癌的治療效果，從而改善患者的預后，青藤堿具有較好的臨床應用前景。