饒鳳琴， 程玉梅， 張婷， 周青帥， 崔古貞， 齊曉嵐**， 洪偉**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&貴州省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 綜合ICU， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

艱難梭菌(clostridiumdifficile)是一種革蘭陽(yáng)性、專性厭氧的產(chǎn)芽孢桿菌[1]。研究顯示，20%～30%抗生素相關(guān)性腹瀉及95%～100%偽膜性結(jié)腸炎均是由艱難梭菌引起的[2]。艱難梭菌感染(clostridiumdifficileinfection,CDI)主要癥狀是腹瀉，病情加重時(shí)會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為偽膜性結(jié)腸炎，甚至導(dǎo)致死亡[3-4]，臨床上診斷CDI主要是基于患者的臨床癥狀及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[5]。糞腸球菌(enterococcusfaecalis)是一種革蘭陽(yáng)性、D-鏈球菌屬、正常存在于人類和其他哺乳動(dòng)物胃腸道中的兼性厭氧菌[6]。作為一種腸道正常寄生菌，其繁殖速度快，對(duì)生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)條件要求低，因此可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)抑制多種腸道病原菌的繁殖[7-8]。從糞便樣本中分離獲得艱難梭菌純培養(yǎng)是臨床判斷CDI最直接的證據(jù)，也是研究臨床艱難梭菌菌株生理、生化特征和致病機(jī)制的重要前提[9]。然而，從臨床糞便標(biāo)本分離艱難梭菌的過(guò)程中，因糞腸球菌具有競(jìng)爭(zhēng)性優(yōu)勢(shì)，常常造成艱難梭菌分離失敗，并由此可能造成對(duì)CDI患者的誤診[10]。因此，建立從糞腸球菌與艱難梭菌共培養(yǎng)物中篩選艱難梭菌的培養(yǎng)方法，是CDI的準(zhǔn)確診斷和臨床菌株獲得的前提[10]。已有研究表明，常用的艱難梭菌分離培養(yǎng)基為腦心浸出液-酵母粉培養(yǎng)基(brain heart infusion yeast, BHIS)[11]、環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂培養(yǎng)基(cycloserine-cefoxitin-fructose agar, CCFA)[12]、胰蛋白胨-酵母粉培養(yǎng)基(tryptone yeast, TY)[13]和胰蛋白胨-酵母粉-葡萄糖培養(yǎng)基(tryptone yeast glucose, TYG)[14]，在糞便樣本中有大量糞腸球菌存在時(shí)這些培養(yǎng)基常發(fā)生艱難梭菌分離失敗。因此，本研究擬探討不同生產(chǎn)廠家BHIS培養(yǎng)基、不同抗生素和是否添加羊血(或血清)組合對(duì)臨床分離艱難梭菌中糞腸球菌污染的去除效果。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)條件

糞腸球菌和艱難梭菌混合物取自醫(yī)院ICU病房患者糞便[15]。艱難梭菌630質(zhì)控菌株購(gòu)自美國(guó)典型菌種保藏中心，腦心浸出液(brain heart infusion, BHI)粉末分別購(gòu)自青島海博生物科技有限公司、杭州微生物試劑有限公司、北京索萊寶科技有限公司和杭州百思生物技術(shù)有限公司，酵母粉購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，胎牛血清購(gòu)自中國(guó)四季青公司，中性紅、瓊脂粉、脫纖維羊血、厭氧產(chǎn)氣袋購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，厭氧培養(yǎng)盒購(gòu)自日本MGC Anaero Pack公司。艱難梭菌置于厭氧培養(yǎng)盒中，37 ℃恒溫靜置培養(yǎng)(液體培養(yǎng)8～12 h，固體平板培養(yǎng)18～24 h)。

1.2 方法

1.2.1培養(yǎng)基的配制 BHIS培養(yǎng)基分別按照不同廠家說(shuō)明書稱取BHI(北京索萊寶3.85 g、青島海博3.85 g、杭州百思3.6 g、杭州微生物5.0 g)、酵母粉0.5 g 加蒸餾水溶解至100 mL純凈水中，BHIS固體培養(yǎng)基瓊脂粉濃度為1.5%；根據(jù)文獻(xiàn)[16]配制CCFA培養(yǎng)基；根據(jù)文獻(xiàn)[13]配制TY培養(yǎng)基；根據(jù)文獻(xiàn)[17]配制TYG培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基均分別加入0.1%膽磺酸鹽和1%半胱氨酸鹽后121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。使用抗生素種類及濃度分別為氯霉素(15 mg/L)、克拉霉素(10 mg/L)、D-環(huán)絲氨酸(250 mg/L)和頭孢西丁(8 mg/L)、四環(huán)素(20 mg/L)和氨芐青霉素(100 mg/L)。在需要時(shí)，額外加入10%胎牛血清(或5 %脫纖維羊血)，固體培養(yǎng)基配制時(shí)額外加入1.5%瓊脂。以上所有培養(yǎng)基均121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，所有抗生素均使用0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌。

1.2.2艱難梭菌抗生素抗性實(shí)驗(yàn) BHIS培養(yǎng)基中分別添加氨芐青霉素(100 mg/L)、氯霉素(15 mg/L)、D-環(huán)絲氨酸(250 mg/L)、頭孢西丁(8 mg/L)、克拉霉素(10 mg/L)或四環(huán)素(20 mg/L)，再取相同濃度的艱難梭菌630純培養(yǎng)物5 μL接種至含有不同抗生素的BHIS培養(yǎng)基中。設(shè)置不添加任何抗生素的BHIS培養(yǎng)基為對(duì)照，不同抗性培養(yǎng)基與對(duì)照均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后用細(xì)菌OD測(cè)量?jī)x測(cè)量培養(yǎng)物濁度。

1.2.3艱難梭菌篩選培養(yǎng)基優(yōu)化 首先，將艱難梭菌純培養(yǎng)物分別接種至不同抗生素BHIS培養(yǎng)基中，以篩選艱難梭菌耐受的抗生素；其次，篩選BHIS、CCFA、TY、TYG培養(yǎng)基與血清、抗生素的組合對(duì)艱難梭菌和糞腸球菌混合菌種的分離效果；最后，篩選不同廠家生產(chǎn)的BHIS對(duì)艱難梭菌和糞腸球菌混合菌種的分離效果?；旌暇涸诓煌囵B(yǎng)基與抗生素、血清的組合中連續(xù)3次傳代后將傳代培養(yǎng)物劃線至與液體培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基上，液體培養(yǎng)基接種量為5%。

1.2.4艱難梭菌的分離效果評(píng)價(jià)方法 (1)顯微鏡鏡檢，觀察不同培養(yǎng)基中的糞腸球菌和艱難梭菌混合培養(yǎng)物是否存在糞腸球菌污染，拍照并選取每一種培養(yǎng)物的3個(gè)視野，計(jì)數(shù)視野中球菌和桿菌，根據(jù)不同培養(yǎng)基中的桿菌所占比例，評(píng)價(jià)各類培養(yǎng)基對(duì)艱難梭菌的分離效果；(2)菌落形態(tài)觀察，混合培養(yǎng)物劃線至固體平板上37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，使用佳能G11相機(jī)拍照記錄菌落形態(tài)，判斷培養(yǎng)物是否為純培養(yǎng)；(3)代謝產(chǎn)物氣味判斷，艱難梭菌在培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生硫化氫氣體、有特征性的臭雞蛋氣味，但糞腸球菌培養(yǎng)物無(wú)明顯刺鼻氣味。

1.2.5菌落16S rDNA測(cè)序及Blastn比對(duì) 將固體平板上形成的不同形態(tài)的單菌落使用PCR擴(kuò)增16S rDNA并測(cè)序。擴(kuò)增的引物為16S rDNA-F ∶GGAGGCAGCAGTGGGGAATA及16S rDNA-R ∶TGACGGGCGGTGTGTACAAG，反應(yīng)聚合酶為諾唯贊?Green Taq mix。PCR條件：預(yù)變性一個(gè)循環(huán)95 ℃ 5 min，94 ℃變性 30 s、56 ℃退火 30 s、72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸一個(gè)循環(huán)5 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物后，送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用使用Blastn程序比對(duì)16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)，以確定菌落種屬(Basic Local Alignment Search Tool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)基篩選

艱難梭菌抗生素抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，艱難梭菌對(duì)氯霉素、克拉霉素和氨芐青霉素敏感，對(duì)四環(huán)素、D-環(huán)絲氨酸和頭孢西丁具有抗性，見(jiàn)表1。BHIS、TY、TYG培養(yǎng)基與各種不同抗生素及血清組合對(duì)艱難梭菌的富集效果顯示，不添加血清的培養(yǎng)基均無(wú)艱難梭菌典型的微黃色菌體沉淀產(chǎn)生，且無(wú)臭雞蛋氣味；添加血清、頭孢西丁或D-環(huán)絲氨酸的BHIS培養(yǎng)中有艱難梭菌典型的微黃色菌體沉淀產(chǎn)生，且伴有濃烈的臭雞蛋氣味；添加四環(huán)素培養(yǎng)基中有微黃色菌體沉淀生成，但沉淀量較少，且臭雞蛋氣味不濃烈；添加其他抗生素培養(yǎng)基均無(wú)菌體沉淀產(chǎn)生，見(jiàn)表2。在青島海博、杭州微生物、北京索萊寶和杭州百思BHIS培養(yǎng)基中均加入10%血清、D-環(huán)絲氨酸和頭孢西丁，在相同艱難梭菌接種量條件下，不同生產(chǎn)廠家BHIS培養(yǎng)基均有艱難梭菌典型的沉淀生成，并伴有濃烈臭雞蛋氣味，見(jiàn)表3。

表1 艱難梭菌抗生素抗性實(shí)驗(yàn)

注：“+”表示對(duì)此抗生素具有抗性，“-”表示對(duì)此抗生素敏感。

2.2 不同培養(yǎng)基中的菌體組成

以空白培養(yǎng)基作為鏡檢對(duì)照，純化前艱難梭菌與糞腸球菌共培養(yǎng)物顯微鏡鏡檢可看到大量球菌和鏈球菌(約占70%)，少量桿菌(30%)，見(jiàn)圖1A、1B；使用添加胎牛血清、D-環(huán)絲氨酸和頭孢西丁的BHIS培養(yǎng)基(即BHIS-BDC培養(yǎng)基)篩選糞腸球菌和艱難梭菌混合物后，所有視野中無(wú)球菌，僅見(jiàn)桿狀細(xì)菌，見(jiàn)圖1C。

表2 不同培養(yǎng)基和抗生素組合對(duì)艱難梭菌的篩選作用

注：(1)沉淀類型中“MB”表示菌體呈米白色、易分散沉淀；“WH”表示菌體呈微黃色、細(xì)絲狀沉淀；(2)“-”表示無(wú)沉淀產(chǎn)生或沒(méi)有臭雞蛋氣味；“+”表示有臭雞蛋氣味，且“+”數(shù)量越多臭雞蛋氣味越濃。

表3 不同廠家BHI培養(yǎng)基對(duì)艱難梭菌分離效果

注：所有培養(yǎng)基中均加入D-環(huán)絲氨酸(250 mg/L)和頭孢西丁(8 mg/L)及10%胎牛血清。

2.3 菌落形態(tài)

糞腸球菌與艱難梭菌混合培養(yǎng)物在BHIS平板上劃線培養(yǎng)，BHIS培養(yǎng)基上可見(jiàn)光滑、凸起、1～2 mm的糞腸球菌菌落，艱難梭菌僅在平板邊緣形成零星菌落，見(jiàn)圖2A；混合菌液在BHIS-BDC培養(yǎng)基中連續(xù)傳代3次，劃線于BHIS-BDC平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)18～24 h，可見(jiàn)培養(yǎng)基表面形成典型艱難梭菌菌落(近圓形、表面粗糙、邊緣不規(guī)則、菌落直徑3～5mm)，見(jiàn)圖2B。

注：A為空白培養(yǎng)基，B為艱難梭菌糞腸球菌混合培養(yǎng)物鏡檢，C為BHIS-BDC培養(yǎng)基分離純化混合培養(yǎng)物后鏡檢；箭頭所指(1)為鏈球菌，(2)為球菌，(3)為桿菌。

注：A為未純化的糞腸球菌與艱難梭菌混合培養(yǎng)物在BHIS固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)，B為純化后的菌株在BHIS-BDC固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)。

2.4 16S rDNA測(cè)序及Blast比對(duì)

在上述平板上分別挑取2個(gè)單克隆，PCR擴(kuò)增其16S rDNA并送測(cè)序，結(jié)果表明1～2 mm菌落為糞腸球菌，3～5 mm直徑菌落為艱難梭菌。見(jiàn)表4。

表4 16S rDNA序列Blast比對(duì)結(jié)果

3 討論

從糞便標(biāo)本中分離艱難梭菌是CDI診斷最直接的證據(jù)[18]。糞腸球菌作為人腸道主要菌群之一，能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)(如細(xì)菌素)，可以抑制沙門氏菌等病原菌的生長(zhǎng)[19]。在臨床檢驗(yàn)實(shí)踐中糞腸球菌極易造成艱難梭菌分離失敗，延誤對(duì)艱難梭菌攜帶者或已發(fā)展為CDI的患者的診斷。為了解決這一問(wèn)題，本研究篩選不同生產(chǎn)廠家的BHIS培養(yǎng)基、不同抗生素以及是否在培養(yǎng)基中添加血液制品等條件對(duì)艱難梭菌分離的影響，結(jié)果表明是否在BHIS中添加血清(或脫纖維羊血)、D-環(huán)絲氨酸和頭孢西丁是獲得艱難梭菌純培養(yǎng)的關(guān)鍵。雖然D-環(huán)絲氨酸和頭孢西丁是艱難梭菌分離的常規(guī)抗生素[20]，但是血清(或脫纖維羊血)可以增加艱難梭菌分離效率尚未見(jiàn)報(bào)道。

抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，艱難梭菌對(duì)氯霉素、克拉霉素和氨芐青霉素敏感，對(duì)四環(huán)素、D-環(huán)絲氨酸和頭孢西丁具有抗性，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。不同培養(yǎng)基和抗生素組合對(duì)艱難梭菌的篩選結(jié)果顯示，改良的BHIS-BDC培養(yǎng)基中有典型的艱難梭菌沉淀生成，并伴有濃烈臭雞蛋氣味，該結(jié)果表明用D-環(huán)絲氨酸和頭孢西丁作為復(fù)合篩選抗生素比單一抗生素可以更有效地抑制糞腸球菌，添加羊血或者胎牛血清則能夠提高艱難梭菌對(duì)糞腸球菌的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是糞腸球菌因?qū)-環(huán)絲氨酸和頭孢西丁敏感，隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸退化。另外，使用不同生產(chǎn)廠家BHIS培養(yǎng)基培養(yǎng)艱難梭菌時(shí)，菌體沉淀量和產(chǎn)生氣味濃烈程度無(wú)明顯區(qū)別，提示不同廠家的BHIS培養(yǎng)基對(duì)艱難梭菌的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯差異。

除了常見(jiàn)的BHIS、TY、TYG、CCFA培養(yǎng)基，有研究顯示可以利用艱難梭菌選擇培養(yǎng)基分離和培養(yǎng)艱難梭菌[22]；也有其他研究者使用商業(yè)化的馬血CCFA培養(yǎng)基從水或者糞便中分離艱難梭菌[23]。但是由于國(guó)內(nèi)目前對(duì)CDI的重視程度不如歐美國(guó)家，所以關(guān)于艱難梭菌配套產(chǎn)品還相對(duì)缺乏，且這些商業(yè)化的培養(yǎng)基價(jià)格昂貴，保質(zhì)期短，本課題組嘗試多種途徑購(gòu)買均未成功。因此，本研究選擇BHIS、TY、TYG、CCFA培養(yǎng)基作為優(yōu)化其起始培養(yǎng)基，研究結(jié)果表明單獨(dú)使用國(guó)產(chǎn)BHIS、TY、TYG和CCFA培養(yǎng)基無(wú)法完全滿足艱難梭菌生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)，與國(guó)外報(bào)道差異明顯[24-25]，這可能是國(guó)外培養(yǎng)基成分與國(guó)產(chǎn)培養(yǎng)基的成分存在差異有關(guān)。

在液體培養(yǎng)基中添加羊血會(huì)使觀察菌體生長(zhǎng)變得困難，因此在配制液體培養(yǎng)基時(shí)，本研究使用胎牛血清代替脫纖維羊血，借助D-環(huán)絲氨酸和頭孢西丁對(duì)糞腸球菌的生長(zhǎng)抑制，使艱難梭菌得以富集、純化。值得注意的是，本研究結(jié)果提示了糞腸球菌在體外環(huán)境下對(duì)艱難梭菌具有強(qiáng)烈的抑制作用，這種抑制作用可能是糞腸球菌某種代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的，該未知的代謝產(chǎn)物可能具有潛在的CDI治療作用，即具有開發(fā)為CDI治療藥物的潛力。然而，代謝產(chǎn)物種類及其抑制艱難梭菌生長(zhǎng)的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)不同生產(chǎn)廠家的BHIS、不同抗生素及不同血液制品的組合，建立了穩(wěn)定、簡(jiǎn)單的艱難梭菌分離方法，提示在BHI培養(yǎng)基中添加羊血和抗生素是去除艱難梭菌中糞腸球菌污染的關(guān)鍵，從而為后續(xù)的艱難梭菌生理、生化、致病性及基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。