劉金河， 葛章文， 張望明， 晏文濤， 劉志， 吳昌學(xué)

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心 貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004; 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州省人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽(yáng) 550002； 4.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科， 貴州 貴陽(yáng) 550001; 5.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

肺癌在我國(guó)癌癥的發(fā)病率和死亡率中均居首位，近年來(lái)發(fā)病呈升高趨勢(shì)[1]。非小細(xì)胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)是肺癌的主要類型，約占肺癌的80%，該類型的肺癌早期特征不明顯，確診時(shí)往往已是中晚期，且術(shù)后的轉(zhuǎn)移率較高，5年生存率僅為20%[2-3]。目前，肺癌的化療主要采用鉑類藥物，如順鉑或卡鉑，但多次使用后會(huì)出現(xiàn)耐藥性，并且患者化療后生活質(zhì)量較差。因此，尋找其他行之有效的藥物及治療途徑對(duì)肺癌治療就有著至關(guān)重要的意義[4]。二氫楊梅素(dihydromyricetin, DMY)是一種黃酮類化合物，主要存在于楊梅科、柳科、葡萄科及藤黃科等植物中，在藤茶屬植物中含量最高[5-6]。最近的研究表明，DMY具有廣泛的藥理活性，能夠通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、多環(huán)節(jié)阻滯及延緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展來(lái)抑制腫瘤的擴(kuò)散[7-8]；DMY還通過下調(diào)semaphorin 4D蛋白表達(dá)來(lái)抑制結(jié)直腸癌的發(fā)展[9]，通過激活PI3K/Akt/ FoxO3a信號(hào)通路來(lái)阻止人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的氧化損傷[10]；臨床上，DMY也能緩解地塞米松造成的肌肉萎縮[11]。但DMY對(duì)肺癌A549細(xì)胞作用的研究相對(duì)較少，本研究采用不同濃度的DMY處理肺癌A549細(xì)胞，觀察處理后A549細(xì)胞的增殖及凋亡情況，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

1.1.1細(xì)胞、藥物和試劑 人肺癌A549 細(xì)胞株購(gòu)自上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所，0.25%胰酶、青霉素、鏈霉素、EDTA、PBS、二甲基亞砜(DMSO)、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自HyClone公司，動(dòng)物細(xì)胞凋亡DNA Ladder抽提試劑盒購(gòu)自碧云天生物有限公司，DMY購(gòu)自上海源葉生物公司，MTT、Hoechst 33342/PI雙染試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物有限公司。

1.1.2主要儀器 Mode l550酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Cellstar公司，低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)HeraeusSepateeh公司，BHZ-RFL-T3熒光倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 取肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基當(dāng)中，置于5% CO2、37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)；細(xì)胞生長(zhǎng)融合度為80%時(shí)，用0.25% 胰蛋白酶消化，隔天換液、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

1.2.2DMY對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌A549細(xì)胞分為1、5、10、15、20 mg/L DMY組(分別加入相應(yīng)量DMY處理細(xì)胞)及對(duì)照組(加入等量DMSO處理細(xì)胞)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，加入5 g/L MTT ，置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸取上清液后，每孔加入二甲基亞砜150 μL，避光孵育10 min 后放在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔在490 nm 處的吸光度值，計(jì)算細(xì)胞抑制率[4],同時(shí)計(jì)算DMY 對(duì)A549細(xì)胞的半數(shù)致死量(IC50值)；選取IC50值附近濃度的 DMY 處理細(xì)胞, 分別在24、48及72 h時(shí)，采用MTT進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)[8]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3DMY誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以5×104個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，置 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將細(xì)胞分為DMY組及對(duì)照組，DMY組加入終濃度大約為IC50值的DMY，對(duì)照組加入等量DMSO，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h、胰酶消化，預(yù)冷的 PBS 洗滌 2 次，Hoechst33342和PI各 5 μL，混勻后4 ℃下避光孵育 25 min，PBS清洗后于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4DMY對(duì)A549細(xì)胞中DNA的影響 參照Li等[11]的實(shí)驗(yàn)方法，采用DNA ladder凝膠電泳觀察A549細(xì)胞中DNA變化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞分為DMY組及對(duì)照組，DMY組加入終濃度大約為IC50值的DMY，對(duì)照組加入等量DMSO，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，胰酶消化，PBS清洗后，離心去上清，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞內(nèi)的DNA，2%的瓊脂糖凝膠跑膠后凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 DMY抑制肺癌A549細(xì)胞增殖

MTT結(jié)果顯示，DMY 作用 A549 細(xì)胞72 h時(shí)，對(duì) A549 細(xì)胞具有顯著的殺傷作用，細(xì)胞抑制率隨著 DMY 濃度的增加逐漸增高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01), 當(dāng)濃度達(dá)到20 mg/L時(shí)，DMY 對(duì) A549 細(xì)胞增殖的抑制率高達(dá)86%(圖1A)，進(jìn)一步計(jì)算可知IC50值為(13.16±0.098)mg/L。選取接近IC50值的 DMY 濃度(15 mg/L DMY)處理A549細(xì)胞，分別在24、48及72 h時(shí)進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)，結(jié)果顯示在處理72 h內(nèi)，細(xì)胞存活率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1B。

注：A為不同濃度DMY處理肺癌A549細(xì)胞72 h，與對(duì)照組比較， (1)P<0.05，(2)P<0.01；B為15 mg/L DMY與肺癌A549細(xì)胞作用不同時(shí)間，與對(duì)照組比較， (1)P<0.05，(2)P<0.01。

2.2 DMY促進(jìn)肺癌A549細(xì)胞凋亡

用 Hoechst 33342/PI 染色觀察 DMY 誘導(dǎo) A549 細(xì)胞的凋亡，對(duì)照組 A549 細(xì)胞用染色劑染色后，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核呈現(xiàn)彌散均勻的淡藍(lán)色熒光；采用15 mg/L DMY 處理A549細(xì)胞 48 h 時(shí)，熒光顯微鏡下可見細(xì)胞核呈現(xiàn)致密的強(qiáng)藍(lán)色熒光，并且染色質(zhì)凝集，提示這些細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)。見圖2。

圖2 對(duì)照組和15 mg/L DMY 處理組肺癌 A549 細(xì)胞凋亡情況(Hoechst 33342/PI，×400)

2.3 DMY誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞DNA斷裂

用DNA ladder試劑盒檢測(cè)DMY對(duì)A549細(xì)胞DNA的影響，對(duì)照組細(xì)胞DNA電泳成一條條帶，未出現(xiàn)Ladder現(xiàn)象；15 mg/L DMY處理48 h時(shí)，A549細(xì)胞中凋亡 DNA 小片段增加，出現(xiàn)Ladder現(xiàn)象。見圖3。

注：對(duì)照組DNA未見梯狀條帶，1號(hào)泳道代表DMY(15 mg/L)。

3 討論

肺癌在所有癌癥的發(fā)病率中居于首位，并且具有臨床表現(xiàn)不明顯，治療效果差的特征。我國(guó)人口眾多，肺癌發(fā)病率居高不下，新發(fā)病例和死亡人數(shù)均超過全球的1/3，且發(fā)病率還在逐年增加[12]。目前的研究顯示，肺癌的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，成為提高治療效果和改善預(yù)后的主要障礙。

近年有研究顯示， DMY 不僅在體外對(duì)人乳腺癌、鼻咽癌、肝癌等多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用[13-16], 活體條件下 DMY 也可以顯著抑制人肝癌 Bel-7402 裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)[17]。在皮膚鱗狀細(xì)胞癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，DMY 能誘導(dǎo)相關(guān)信號(hào)通路啟動(dòng)細(xì)胞自噬死亡程序[18-19]。DMY 作為一種黃酮類化合物，不僅具有廣泛的抗腫瘤活性還具有其他藥理學(xué)活性，其在抗菌[20]、抗神經(jīng)炎癥[21]、抗肝細(xì)胞[22]及心肌損傷[23]等方面具有顯著的效果，最近的研究還發(fā)現(xiàn)其對(duì)睡眠的改善也有一定的作用[24]。DMY在藤茶屬植物中含量最高，并且在國(guó)內(nèi)分布廣泛、取材容易、價(jià)格合理，若能開發(fā)為抗腫瘤藥物，成藥后價(jià)格便宜，具有先天的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，本研究中采用DMY干預(yù)肺癌 A549 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)DMY能抑制細(xì)胞增殖，并且很小劑量時(shí)就具有極顯著的效果，且具有濃度及時(shí)間依賴性(P<0.01)。15 mg/L的DMY干預(yù) 肺癌A549 細(xì)胞 48 h后，細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)，DNA ladder顯示細(xì)胞中的基因組 DNA 不同程度被打斷，說(shuō)明DMY能夠通過引起 A549 細(xì)胞內(nèi)DNA的程序性斷裂而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。由此可見，DMY 對(duì)肺癌 A549細(xì)胞增殖有良好抑制效果，在治療肺癌方面具有較大的臨床研究?jī)r(jià)值。