饒鳳琴， 吳昌學(xué)， 崔古貞， 程玉梅， 齊曉嵐**， 洪偉**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&貴州省分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 綜合ICU， 貴州 貴陽 550004)

艱難梭菌(Clostridioidesdifficile)是一種革蘭陽性、專性厭氧的產(chǎn)芽孢桿菌，是導(dǎo)致艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的主要原因[1]。艱難梭菌感染(Clostridioidesdifficileinfection，CDI)的臨床表現(xiàn)可從輕度、短暫性、自限性腹瀉到可危及生命的偽膜性結(jié)腸炎[2-3]。正常人體腸道內(nèi)微生物處于平衡狀態(tài)，抗生素的使用會(huì)擾亂腸道內(nèi)微生物群落的平衡，進(jìn)而導(dǎo)致有益微生物種類和數(shù)量減少，使有益微生物對(duì)艱難梭菌的阻遏效應(yīng)被解除，艱難梭菌迅速占據(jù)腸道生態(tài)位，大量繁殖并產(chǎn)生毒素(tcdA、tcdB及二元毒素)，這些毒素攻擊腸上皮細(xì)胞，導(dǎo)致腸道炎癥，最終導(dǎo)致CDI的發(fā)生[4]。近年來，隨著艱難梭菌強(qiáng)毒株核糖體027型的出現(xiàn)，CDI表現(xiàn)出高致死率和高復(fù)發(fā)率的特征，因而日益受到研究者的關(guān)注[5]。2011年，美國大約有近50萬人感染艱難梭菌，約29 000人因CDI而死亡，2013年美國疾病控制與預(yù)防中心將C.difficile列為需要緊急控制的病原微生物[6]。對(duì)歐洲多個(gè)國家的研究數(shù)據(jù)顯示，CDI確診后30 d內(nèi)CDI的死亡率從3%(法國)～30%(英國)不等[7]。所以，對(duì)艱難梭菌生物特性進(jìn)行深入研究對(duì)防治CDI具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，艱難梭菌黏附于宿主腸細(xì)胞表面對(duì)其進(jìn)一步的定值、入侵以及毒力因子發(fā)揮作用尤為重要，如無法黏附于宿主細(xì)胞，便無法進(jìn)一步的定植，將迅速被宿主細(xì)胞的非特異性防御機(jī)制清除，而艱難梭菌黏附過程由多種黏附因子共同作用。許多研究已經(jīng)確定了涉及黏附和定殖過程的因素，如S層蛋白、黏附素Cwp66、鞭毛、熱休克蛋白GroEL和水解酶等，影響這些因素的黏附因子中，目前已知的有細(xì)胞壁結(jié)合蛋白(Cwp6、Cwp8、Cwp2)、S層蛋白(SlpA)、細(xì)胞表面蛋白(Cwp66)、熱休克蛋白(GroEL)、纖維連接蛋白(Fbps)、鞭毛蛋白(FliC、FliD)及脂蛋白(CD0873)等。研究這些黏附因子對(duì)于CDI的防治具有極其重要的意義，本文就黏附因子的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞壁結(jié)合蛋白及S層蛋白(S-layer protein)

艱難梭菌細(xì)胞壁蛋白絕大多數(shù)屬于細(xì)胞壁結(jié)合蛋白(cell wall binding proteins，CWPs)大家族，這個(gè)家族包括S層蛋白(S layer protein，Slp)、半胱氨酸蛋白酶Cwp84和相變蛋白CwpV[8]。Slp是細(xì)胞表面最豐富的蛋白質(zhì)，艱難梭菌在其表面表達(dá)一個(gè)S層，在電鏡下形成一個(gè)規(guī)則的二維陣列，每個(gè)菌株攜帶一個(gè)S層，由2種不同的蛋白質(zhì)組成，一種是高分子量蛋白P47，另一種是低分子量蛋白P36，都由slpA基因編碼。SlpA是S層蛋白之一，用粗制或純化的SlpA預(yù)處理宿主細(xì)胞，或用抗SlpA血清培養(yǎng)艱難梭菌，均可顯著減少艱難梭菌對(duì)細(xì)胞的黏附，表明該蛋白對(duì)艱難梭菌的黏附能力有影響[9-10]。細(xì)胞壁結(jié)合蛋白Cwp2，也是S層蛋白之一。艱難梭菌菌株cwp2基因缺失突變株對(duì)人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞CaCo-2的黏附能力比野生型低(85.7±14.0)%。cwp2基因的失活還會(huì)導(dǎo)致毒素TcdA在體外釋放增加，提示Cwp2在宿主細(xì)胞黏附中發(fā)揮重要促進(jìn)作用[11]。最近的研究表明，在細(xì)胞黏附過程中，多糖與蛋白質(zhì)的相互作用可能也發(fā)揮了重要作用。2008年，Ganeshapillai等[12]分析出艱難梭菌細(xì)胞表面多糖主要由五糖基(PS-Ⅰ)和磷酸六糖基(PS-Ⅱ)構(gòu)成。Usenik等[13]發(fā)現(xiàn)CWP6與CWP8通過各自的三串聯(lián)CWB2基序錨定到PS Ⅱ結(jié)構(gòu)上。類似的機(jī)制在炭疽芽孢桿菌中也有報(bào)道，CWPs可通過S層同源(SLH)基序的偽三聚體排列與丙酮基化的次生細(xì)胞壁多糖非共價(jià)結(jié)合。與炭疽桿菌一樣，艱難梭菌CWP-CWB-Motif形成三聚體，能夠與PS-Ⅱ結(jié)合，可能是艱難梭菌與細(xì)胞壁結(jié)合蛋白識(shí)別，結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[9-14]。用蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件Swiss-Model(https://www.swissmodel.expasy.org/)同源建模SlpA、Cwp6、Cwp8三級(jí)結(jié)構(gòu)模型(圖1)，Cwp6由3個(gè)CWB2基序串聯(lián)組成，Cwp8中結(jié)構(gòu)域2(CWB2)位于分子的左端，該結(jié)構(gòu)域由殘基K94-S175組成，由一條α螺旋，螺旋一側(cè)的三條反平行β鏈和另一側(cè)的發(fā)夾組成。SlpA與Cwp6，Cwp8具有同樣的CWB2串聯(lián)基序。膠原蛋白A，即CbpA屬于附基質(zhì)分子MSCRAMM家族，對(duì)膠原蛋白有黏附性，是艱難梭菌細(xì)胞壁錨定蛋白，可暴露在細(xì)菌表面，靶向人體腸道細(xì)胞膠原蛋白，從而對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附定植過程中具有一定程度的貢獻(xiàn)[15]。以上這些說明細(xì)胞壁上的結(jié)合蛋白可能通過靶向識(shí)別并結(jié)合腸腺細(xì)胞上的信號(hào)蛋白使細(xì)菌的黏附能力增加。

注：A為SlpA，B為Cwp6，C為Cwp8。

2 細(xì)胞表面蛋白

Cwp66是艱難梭菌中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)并證明的黏附因子，也稱為黏附素蛋白。2001年，Waligora等[16]研究證實(shí)艱難梭菌在經(jīng)過60 ℃熱激處理后黏附細(xì)胞能力的增強(qiáng)是由細(xì)胞表面蛋白Cpw66所介導(dǎo)，這種熱激后黏附能力增加的現(xiàn)象，受到Cwp66抗體抑制。有趣的是Roberts[17]在2003年用反義RNA方法敲降艱難梭菌cwp66基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)敲降后的艱難梭菌在蛋白表達(dá)和黏附方面均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這個(gè)結(jié)果與Waligora等[16]的發(fā)現(xiàn)相悖，造成這種相悖結(jié)果可能的原因是反義RNA敲降cwp66的方法可能對(duì)該基因的表達(dá)抑制并不完全，cwp66完全敲除可能真正解開Cwp66蛋白功能的“神秘面紗”。

3 熱休克蛋白

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSP)被認(rèn)為是許多細(xì)菌病原體的主要抗原，一些微生物表達(dá)免疫原性GroEL(HSP60)同源物，會(huì)引起宿主免疫原性反應(yīng)。抗生素的使用讓腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，艱難梭菌抗生素壓力狀態(tài)，GroEL的表達(dá)會(huì)增加，GroEL表達(dá)上升會(huì)增加艱難梭菌細(xì)胞黏附能力[18-19]。

4 纖維連接蛋白

纖維連接蛋白(fibronectin)，是一種普遍存在于脊椎動(dòng)物體液和細(xì)胞外基質(zhì)中約450 kDa的糖蛋白。纖維連接蛋白結(jié)合蛋白(fibronectin-binding protein，F(xiàn)bps)是一種黏附蛋白，主要存在于鏈球菌和葡萄球菌中。在革蘭陽性菌中，F(xiàn)bps暴露于細(xì)菌表面，通過甘氨酸(LPXTG)與細(xì)胞壁錨定。2003年，Hennequin等[20-21]發(fā)現(xiàn)艱難梭菌與纖維連接蛋白、纖維蛋白原、膠原蛋白和玻璃體連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合，從而定植于宿主細(xì)胞。與纖連蛋白的結(jié)合是由于存在由fbp68基因編碼的Fbps，介導(dǎo)了細(xì)菌與宿主細(xì)胞的纖維連接蛋白結(jié)合，使細(xì)菌附著在組織上。

5 鞭毛蛋白

鞭毛(flagellum)是許多細(xì)菌都具有的幫助細(xì)菌運(yùn)動(dòng)的器官，在很多病原菌產(chǎn)生毒素過程發(fā)揮了重要作用，如參與空腸彎曲桿菌和嗜肺軍團(tuán)菌的內(nèi)化，參與空腸彎曲桿菌、幽門螺桿菌的細(xì)胞黏附及定植等[22-25]。一些研究者由此推測(cè)艱難梭菌在腸道的黏附定植與鞭毛相關(guān)蛋白有關(guān)，并做了一系列研究。Tasteyre等[26]提出鞭毛蛋白FliC與FliD參與了C.difficile與細(xì)胞的黏附過程。Dingle等[27]將編碼FliC與FliD的基因fliC和fliD敲除后，艱難梭菌對(duì)腸腺細(xì)胞的黏附能力增加。Barketi等[28]將fliC失活后，艱難梭菌毒性基因表達(dá)會(huì)上調(diào)。這些研究說明了艱難梭菌鞭毛蛋白的存在對(duì)黏附過程有抑制作用，進(jìn)一步推測(cè)鞭毛對(duì)細(xì)菌黏附有阻礙作用。

6 脂蛋白

脂蛋白對(duì)諸如綠膿桿菌，布魯氏菌等病原菌與宿主細(xì)胞的黏附有關(guān)，為研究脂蛋白CD0873與艱難梭菌黏附的關(guān)系，研究者使用ClosTron系統(tǒng)構(gòu)建了突變株，突變株對(duì)Caco-2(人腸腺上皮細(xì)胞系)細(xì)胞黏附能力顯著降低，且CD0873抗體也能顯著降低艱難梭菌對(duì)Caco-2細(xì)胞的黏附能力，顯示了脂蛋白CD0873也參與了艱難梭菌的細(xì)胞黏附過程[29]。

7 總結(jié)與展望

近年來， CDI受到越來越多的重視，尤其是在中國，隨著艱難梭菌院內(nèi)感染病例報(bào)道逐漸增多，越來越多的學(xué)者把目光轉(zhuǎn)移到CDI致病機(jī)制的研究[30-32]。艱難梭菌會(huì)導(dǎo)致抗生素性腹瀉產(chǎn)生，嚴(yán)重者可發(fā)展為危及生命的偽膜性結(jié)腸炎。CDI過程中，艱難梭菌黏附于腸壁細(xì)胞是關(guān)鍵的步驟，當(dāng)艱難梭菌黏附于腸上皮細(xì)胞后，細(xì)胞中某種因子激活艱難梭菌毒性基因，大量產(chǎn)生TcdA、TcdB及二元毒素CDT毒素，這些毒素進(jìn)一步內(nèi)化進(jìn)入腸腺細(xì)胞，破壞正常的細(xì)胞連接，與宿主免疫系統(tǒng)發(fā)生相互作用，最終導(dǎo)致CDI的發(fā)生。艱難梭菌黏附定植于宿主細(xì)胞是由多種黏附因子介導(dǎo)，目前研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞壁結(jié)合蛋白Cwp8、Cwp6、Cwp2，S層蛋白SlpA，細(xì)胞表面蛋白Cwp66，熱休克蛋白GroEL，纖維連接蛋白Fbp68，鞭毛蛋白FliC、FliD，脂蛋白CD0873等參與了艱難梭菌與腸上皮細(xì)胞的黏附過程。這些黏附因子氨基酸組成中，大部分由賴氨酸主導(dǎo)，且環(huán)狀折疊占比較多(42.1%～58.7%)，這提示了黏附作用可能和蛋白質(zhì)的組成和折疊方式有關(guān)，但是具體的關(guān)聯(lián)還亟待研究。對(duì)艱難梭菌黏附因子的作用進(jìn)行研究，對(duì)于了解艱難梭菌吸附、入侵宿主和逃避宿主的免疫系統(tǒng)非常重要，這些黏附因子可以根據(jù)其功能制備成疫苗和各種檢測(cè)試劑，如黏附因子FliC可做成疫苗，進(jìn)行CDI的防治。目前，在倉鼠模型中以FliC膠囊作為口服疫苗預(yù)防CDI已經(jīng)取得成功，若能夠順利應(yīng)用到臨床上，這將是一個(gè)防治CDI的重大突破[33]。而對(duì)于其他已知或未知黏附因子的研究，如黏附因子的表達(dá)調(diào)控過程、與細(xì)胞之間的相互作用，以及與毒素的表達(dá)調(diào)控關(guān)系尚不明確，還有待更加深入的研究。此研究的難點(diǎn)有2點(diǎn)：(1)艱難梭菌擁有的基因組過多，確定與CDI致病相關(guān)的基因種類、數(shù)量及名稱極其困難；(2)對(duì)于基因功能的研究，基因敲除是一個(gè)非常重要的方式，而艱難梭菌基因敲除系統(tǒng)還不完善，有待研究者完善。