顧 倩，丁維維，蔣明月，蘇曉帥，李小娟，肖 凱

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河北 保定 071001)

磷素供應(yīng)水平對作物生化代謝、生長發(fā)育和產(chǎn)量形成能力具有重要影響。由于磷素在土壤中容易被吸附和固定的特性，土壤中的磷素多以不能被植物吸收利用的難溶態(tài)形式存在，長期施用磷肥已經(jīng)成為改善作物產(chǎn)量的重要途徑之一[1]。提高土壤中磷素和施用磷肥的利用效率，對于緩解世界范圍內(nèi)的磷資源緊缺，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[2]。

前人研究表明，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植株應(yīng)答低磷逆境過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。其中，鋅指蛋白作為一類重要轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合Zn2+后形成短的可折疊成“手指”的結(jié)構(gòu)，執(zhí)行特定的生物學(xué)功能。根據(jù)半胱氨酸和組氨酸的數(shù)量與位置，鋅指轉(zhuǎn)錄因子分為C2H2、C2HC、C2HC5、C2C2、CCCH、C3HC4、C4、C4HC3、C6和C8型等類型[5]。在植物種屬中，C2H2型鋅指蛋白參與了許多重要的代謝途徑和應(yīng)答脅迫及防衛(wèi)激活的反應(yīng)[6-9]。近年來研究表明，C2H2型鋅指蛋白還參與植株應(yīng)答低磷逆境的過程。如擬南芥的C2H2型基因Zat6的表達(dá)與根發(fā)育和細(xì)胞中磷穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)有關(guān)，過表達(dá)Zat6擬南芥株系，植株抵御低磷逆境的能力顯著增強(qiáng)[10]。

作者前期研究表明，1個C2H2型小麥鋅指基因TaZAT8呈低磷脅迫誘導(dǎo)特征，過表達(dá)該基因的煙草株系，通過上調(diào)表達(dá)磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因及保護(hù)酶基因等途徑，具有改善植株抵御低磷逆境的能力[11]。為進(jìn)一步揭示TaZAT8調(diào)控植株應(yīng)答低磷逆境分子機(jī)制，本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對正常培養(yǎng)的野生型與轉(zhuǎn)TaZAT8基因煙草株系蛋白表達(dá)譜進(jìn)行了分析，旨在從蛋白水平闡明該基因參與調(diào)控的生物學(xué)過程。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為作物高產(chǎn)抗逆分子生物學(xué)實驗室野生型和過表達(dá)TaZAT8基因煙草(N.tabacumcv Wisconsin 38)[11]。

挑選飽滿健康的野生型和過表達(dá)TaZAT8基因煙草種子，用75%酒精殺菌1 min，無菌水清洗后分別撒在濕潤蛭石上，28 ℃暗培養(yǎng)約7 d萌芽，待生長到四-五葉期時挑選長勢一致的幼苗移植到培養(yǎng)盤中，使用Hoagland′s營養(yǎng)液培養(yǎng)10～15 d左右收取幼苗根系，液氮凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蛋白組學(xué)試驗及方法

1.2.1 蛋白質(zhì)樣品制備及含量測定 采用酚抽提法提取煙草植株根部總蛋白[12]，將1 g 樣品在液氮下充分研磨成極細(xì)粉，加提取液4 mL，化凍后加PMSF(100∶1)和1.3 mol/L DTT(50∶1)，繼續(xù)研磨至勻漿后轉(zhuǎn)入離心管，加入4 mL Tris-飽和酚振蕩30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清，加入等體積抽提液4 000 r/min振蕩25 min，離心15 min。取上清，加入4～5倍體積的0.1 mol/L甲醇醋酸銨上下顛倒混勻，-20 ℃沉淀2 h以上，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清。用冷甲醇和冷丙酮分別洗滌沉淀3次后于真空冷凍干燥機(jī)中干燥。蛋白干粉先以每1.4 mg干粉加100 μL Lysis Buffer(7 mol/L 尿素, 2 mol/L 硫脲, 4% CHAPS, 2% 安福靈 pH值3.5～10，1% DTT)的比例溶解，采用 Bradford 蛋白定量方法測定蛋白濃度。

1.2.2 蛋白質(zhì)雙向電泳

1.2.2.1 第一向固相pH值梯度等電聚焦 雙向電泳第一向采用長度13 cm，pH值 4～7的線性干膠條，將蛋白提取液與水化緩沖液(1% DTT、1% IPG Buffer、1×BPB、RB)混合至總體積250 μL，加入到GE水化盤中，覆蓋上干膠條泡脹過夜(10～12 h)。把泡脹好的膠條轉(zhuǎn)移到等電聚焦盤，按以下參數(shù)進(jìn)行聚焦：300 V 1 h S、500 V 1 h S、1 000 V 1 h S、8 000 V 2 h G、8 000 V 2 h S、500 V 12 h S 保護(hù)電壓。第一向電泳結(jié)束后，將膠條置于平衡緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、6 mol/L尿素、30%甘油、2% SDS、0.002%溴酚藍(lán))平衡2次，每次15 min。第一次平衡和第二次平衡分別在緩沖液中加入100 mmol/L DTT 和250 mmol/L IAA。

1.2.2.2 第二向SDS-PAGE電泳 將平衡好的膠條加到二向膠面上，30 mA每塊膠，直至電泳結(jié)束。

1.2.3 染色成像及分析

1.2.3.1 染色與掃描 將電泳完成的膠片放到固定液中(40 mL 乙醇、25 mL 冰醋酸、50 mL超純水)固定20 min后，轉(zhuǎn)移至0.1%的考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色2 h。染色完畢將膠片轉(zhuǎn)移到脫色液中脫色直至蛋白點清晰。打開Image Scanner掃描儀及掃描軟件，掃描成像。

1.2.3.2 圖像分析 轉(zhuǎn)基因樣品與對照之間的差異點通過Image Master 2D Platinum 7分析軟件進(jìn)行分析，設(shè)定相應(yīng)的landmark作為內(nèi)標(biāo)，通過軟件計算蛋白點相對含量的變化來確定蛋白表達(dá)的變化。差異蛋白點為相對表達(dá)豐度上調(diào)(出現(xiàn))或下調(diào)差異大于1.5倍(Ratio>1.5)，并且在統(tǒng)計學(xué)t檢驗上P<0.05的蛋白質(zhì)。

1.2.4 質(zhì)譜分析 挖取差異蛋白，送華大蛋白公司應(yīng)用MicroTOF-QII(Bruker Daltonics)質(zhì)譜儀進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定。

1.2.5 蛋白質(zhì)功能鑒定 對鑒定蛋白質(zhì)進(jìn)行GO分析，注釋生物過程和分子功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達(dá)TaZAT8基因煙草蛋白表達(dá)譜分析

采用雙向電泳技術(shù)，獲得正常培養(yǎng)的野生型與過表達(dá)TaZAT8基因煙草株系的蛋白表達(dá)譜。利用Image Master 2D Platinum 7分析軟件對圖像進(jìn)行分析，共得到811個蛋白點，其中有22個蛋白點的表達(dá)量發(fā)生了變化(圖1)，包括上調(diào)蛋白(U)20個(其中包含1個誘導(dǎo)蛋白)，下調(diào)蛋白(D)2個(圖1)。

差異蛋白點用箭頭標(biāo)出。The differentially expressed protein spots are indicated by arrows.

2.2 差異蛋白鑒定

22個差異蛋白的表達(dá)量變化在1.76～3.72倍(表1)，挖取后酶解進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定。參考Schiltz等[13]的分類標(biāo)準(zhǔn)，上述22個差異蛋白點歸屬于6個功能類別，包括物質(zhì)代謝(U1、U2、U6、U12和U14，22.7%)、逆境應(yīng)答與細(xì)胞保護(hù)(U3、U4、U8和U17，18.2%)、能量代謝(U5、U10、U13、 U19 和D1，22.7%)、轉(zhuǎn)錄翻譯(U7、U16、U18和D2，18.2%)、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換(I1、U11和U15，13.6%)和未知蛋白類(U9，4.5%)(表1)。鑒定的差異蛋白以物質(zhì)代謝類和能量代謝類別最多，其中物質(zhì)代謝涉及氨基酸、次生物和糖復(fù)合物等的合成；能量代謝包括部分糖酵解和三羥酸循環(huán)的酶類。其次是逆境響應(yīng)與細(xì)胞保護(hù)類別，超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化物酶等得到鑒定，可見過表達(dá)TaZAT8對多個生物學(xué)過程產(chǎn)生了影響。

表1 過表達(dá)TaZAT8基因煙草根系差異表達(dá)蛋白Tab.1 Identification of proteins that were significantly differentially expressed in tobacco root overexpressing TaZAT8

表1(續(xù))

注： I、U和D分別為與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株中誘導(dǎo)、上調(diào)和下調(diào)的蛋白。差異倍數(shù).表示相對表達(dá)量差異倍數(shù)。數(shù)值為倍數(shù)平均值±s(n=3)。

Note:I, U and D represent induced, upregulated and downregulated spots respectively in transgenic lines when compared with wild plants.Fold change.The fold change relative expression amount of wild and overexpressing lines samples.Date are presented as means±s(n=3).

2.3 差異蛋白點亞細(xì)胞定位分析

利用Softberry程序，對鑒定的差異蛋白亞細(xì)胞定位特征進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果表明，10個差異蛋白(U1、U2、U4、U5、U9、U11、U13、U17、U18、U19)定位于細(xì)胞質(zhì)中，組成了最大的一類亞細(xì)胞定位蛋白；另有7個蛋白(U3、U6、U10、U12、U14、U16、D1)定位于線粒體中；還包括2個(U8、I1)過氧化物酶體定位蛋白；2個(U7、U15)細(xì)胞核定位蛋白；此外，還有1個蛋白(D2)定位于葉綠體(圖 2)。

2.4 差異表達(dá)蛋白GO分析

對成功鑒定的差異蛋白進(jìn)行生物過程GO分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，22個鑒定蛋白屬于19個GO分類。其中，包含蛋白質(zhì)數(shù)目最多的為參與小分子代謝過程，共有6個，其次為分別包含4個蛋白參與的分解代謝、細(xì)胞氮化合物代謝、代謝物前體和能量產(chǎn)生、生物合成過程，分別包含3個蛋白參與的碳水化合物代謝、單一生物過程、單機(jī)體碳水化合物代謝、逆境應(yīng)答，2個蛋白參與的單機(jī)體分解代謝、細(xì)胞氨基酸代謝、輔因子代謝、硫化物代謝和細(xì)胞蛋白質(zhì)修飾過程(圖3)；在分子功能GO分析中，鑒定的差異蛋白分別屬于15個GO分類。其中，10個蛋白質(zhì)屬于離子結(jié)合分類，5個屬于氧化還原酶類。結(jié)果表明，過表達(dá)TaZAT8基因?qū)ξ镔|(zhì)代謝、能量產(chǎn)生、逆境應(yīng)答等生物過程產(chǎn)生調(diào)控效應(yīng)，在分子功能中則主要參與離子結(jié)合和氧化還原酶活性的調(diào)節(jié)(圖3)。

圖2 野生型和過表達(dá)TaZAT8基因植株差異表達(dá)蛋白亞細(xì)胞定位分析Fig.2 Subcellular localization analysis of differentially expressed proteins in wild and over expressing TaZAT8 plants

1.小分子代謝過程；2.分解代謝過程；3.細(xì)胞氮化合物代謝過程；4.代謝物前體和能量產(chǎn)生過程；5.生物合成過程；6.碳水化合物代謝過程；7.單一生物過程；8.單機(jī)體碳水化合物代謝過程；9.逆境應(yīng)答；10.單機(jī)體分解代謝過程；11.細(xì)胞氨基酸代謝過程；12.輔因子代謝過程；13.硫化物代謝過程；14.細(xì)胞蛋白質(zhì)修飾過程；15.DNA代謝過程；16.染色體組織生物過程；17.tRNA代謝過程；18.蛋白質(zhì)折疊；19.內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)育；20.離子結(jié)合功能；21.氧化還原酶活性；22.甲基轉(zhuǎn)移酶活性；23.解旋酶活性；24.激酶活性；25.翻譯因子活性；26.酶結(jié)合；27.肽酶活性；28.核酸酶活性；29.ATP酶活性；30.裂解酶活性；31.異構(gòu)酶活性；32.連接酶活性。

1.Small molecule metabolic process；2.Catabolic process；3.Cellular nitrogen compound metabolic process；4.Generation of precursor metabolites and energy；5.Biosynthetic process；6.Carbohydrate metabolic process；7.Single-organism biosynthetic process；8.Single-organism carbohydrate metabolic process；9.Response to stress；10.Single-organism catabolic process；11.Cellular amino acid metabolic process；12.Cofactor metabolic process；13.Sulfur compound metabolic process；14.Cellular protein modification process；15.DNA metabolic process；16.Chromosome organization biological process；17.tRNA metabolic process；18.Protein folding；19.Anatomical structure development；20.Binding molecular function；21.Oxidoreductase activity；22.Methyltransferase activity；23.Helicase activity；24.Kinase activity；25.Translation factor activity, RNA binding；26.Enzyme binding；27.Peptidase activity；28.Nuclease activity；29.ATPase activity；30.Lyase activity；31.Isomerase activity；32.Ligase activity.

圖3 差異蛋白質(zhì)GO功能注釋結(jié)果
Fig.3 GO function annotation results of differentially expressed proteins

3 討論與結(jié)論

研究證實，C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子在介導(dǎo)植株抵御低磷等非生物逆境的過程中發(fā)揮重要功能。對擬南芥的研究表明，過表達(dá)C2H2鋅指蛋白基因Zat6的擬南芥植株增強(qiáng)了對低磷脅迫的抵御[10]。作者前期對過表達(dá)小麥該類轉(zhuǎn)錄因子基因TaZAT8的煙草植株研究表明，低磷逆境下轉(zhuǎn)化株系通過多個過程的調(diào)節(jié)，介導(dǎo)了植株對低磷逆境的響應(yīng)[11]。

本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，鑒定了在過表達(dá)TaZAT8煙草根系發(fā)生差異表達(dá)的22個蛋白。上述蛋白分布于細(xì)胞的不同部位，參與了不同代謝過程或體現(xiàn)不同類別的酶活性。其中5個參與物質(zhì)代謝的蛋白發(fā)生上調(diào)表達(dá)，包括2個甲硫氨酸合成酶蛋白點(U1和U2)。該酶是植物必需氨基酸甲硫氨酸合成的關(guān)鍵酶，通過其代謝產(chǎn)物可控制乙烯等關(guān)鍵代謝物水平[14]。此外，與煙堿合成相關(guān)的腐胺N甲基轉(zhuǎn)移酶(U6)也在轉(zhuǎn)基因煙草中上調(diào)表達(dá)。水解酶(U12)經(jīng)同源查詢?yōu)殇\磷酸二酯酶ELAC2，其功能是在鋅離子存在的情況下水解細(xì)胞內(nèi)第二信使。UDP-D芹菜糖/UDP-D木糖合酶(U14)是許多糖復(fù)合物合成的重要核苷糖供體[15]。上述結(jié)果表明，過表達(dá)TaZAT8基因?qū)χ仓牦w內(nèi)多個物質(zhì)代謝過程具有明顯的調(diào)控效應(yīng)。

22個差異蛋白中還有5個參與能量代謝。磷酸甘油酸激酶(PGK, U5)和三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH, U19)是EMP途徑的重要酶類。GAPDH在植物抗氧化脅迫和應(yīng)答氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。有研究表明，水稻三磷酸甘油醛激酶OsGAPC3通過提高過氧化氫酶活性避免了鹽脅迫下H2O2對細(xì)胞的傷害[16]。異檸檬酸脫氫酶(ICDH, U10)是TCA循環(huán)的限速酶[17]，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(U13)催化磷酸烯醇式丙酮酸產(chǎn)生草酰乙酸，為TCA循環(huán)補(bǔ)充原料。核苷二磷酸激酶(NDPK, D1)轉(zhuǎn)移NTP和NDP之間的高能磷酸基團(tuán)，參與植物生長發(fā)育和逆境應(yīng)答等。上述差異表達(dá)蛋白參與了過表達(dá)TaZAT8植株中能量水平供應(yīng)和保護(hù)功能。

包括錳超氧化物歧化酶(U3)、胞質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶(U4)、錨蛋白HBP1(U8)和胞質(zhì)NADP蘋果酸酶NADP-ME(U17)的4個逆境響應(yīng)與細(xì)胞保護(hù)類差異蛋白也在本研究中被鑒定。超氧化物歧化酶和抗壞血酸過氧化物酶是重要抗氧化劑，通過清除活性氧減輕細(xì)胞活性氧損傷[18-19]。NADP蘋果酸酶保持植物細(xì)胞滲透勢和清除活性氧等方面起重要作用[20-21]。有報道指出，NADP-蘋果酸酶的表達(dá)受到干旱誘導(dǎo)，超表達(dá)水稻NADP-蘋果酸酶基因增強(qiáng)了擬南芥株系的抗鹽脅迫能力[22-23]。因此，過表達(dá)TaZAT8植株通過增強(qiáng)上述保護(hù)蛋白的表達(dá)水平優(yōu)化了活性氧清除和保護(hù)系統(tǒng)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，3個蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換類蛋白包括蛋白酶體β4亞基(I1)、2個上調(diào)蛋白FK506結(jié)合蛋白(U11)和泛素結(jié)合酶E2(U15)呈上調(diào)或誘導(dǎo)表達(dá)。其中，F(xiàn)K506結(jié)合蛋白(FKBPs)作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的輔助折疊，在逆境防御和生長發(fā)育等過程扮演重要角色[24-25]。蛋白酶體β4亞基和泛素結(jié)合酶E2為泛素蛋白酶體途徑重要組分，可對蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性降解，清除損傷或異常蛋白質(zhì)，參與植株逆境應(yīng)答、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡等生理過程[26]。過表達(dá)擬南芥泛素結(jié)合酶UBC32，植株對鹽分脅迫的抗性增強(qiáng)[27]。水稻OsPHO2基因編碼泛素結(jié)合酶E2，研究發(fā)現(xiàn)其與磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白OsPHF1及OsPHO1;2互作，構(gòu)建磷饑餓應(yīng)答信號重要途徑[28]。上述結(jié)果表明TaZAT8還通過穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)或胞內(nèi)蛋白降解途徑，參與磷脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。

本研究采用雙向電泳技術(shù)，獲得野生型與過表達(dá)TaZAT8基因煙草株系的蛋白表達(dá)譜，挖取22個差異點進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜分析，鑒定的差異蛋白主要參與物質(zhì)代謝、逆境響應(yīng)及細(xì)胞保護(hù)、蛋白質(zhì)降解、分子伴侶水平以及能量調(diào)控。亞細(xì)胞定位預(yù)測以上蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體、過氧化物酶體、細(xì)胞核和葉綠體等部位；GO分析表明，差異蛋白參與了不同代謝過程或體現(xiàn)不同類別的酶活性。綜上，TaZAT8通過調(diào)控細(xì)胞保護(hù)、物質(zhì)和能量代謝、逆境響應(yīng)蛋白的表達(dá)水平，為增強(qiáng)植株應(yīng)答和抵御低磷逆境奠定了基礎(chǔ)。