張朝紅，陳東玫，楊鳳秋，趙同生，李 揚，趙國棟，趙永波

(河北省農(nóng)林科學院 昌黎果樹研究所，河北 昌黎 066600)

果銹(Russeting，RUS)是蘋果[1]、梨[2]、葡萄[3]、馬鈴薯[4-5]等作物的重要性狀之一。馬鈴薯的銹變品種Russet Burbank因綜合了高產(chǎn)、低糖、吸油少、耐貯藏、適宜加工等特性，在美國、加拿大、法國、英國、新西蘭等多地廣泛種植[4,6]。梨的果銹與果皮色澤密切相關，并對生物、非生物脅迫起到一定的保護作用[2,7]。蘋果多銹品種金冠、Elstar、桔蘋因果銹的頻繁發(fā)生使其果實的商品價值銳減[8-11]，成為限制該類品種持續(xù)發(fā)展的一大障礙。

蘋果、梨等樹種幼嫩果實(或塊莖)受到氣候、病菌、藥劑等因子的作用時，它的表皮細胞異常分裂、增殖而開裂，其下層細胞膨大木栓化產(chǎn)生木栓形成層，進而形成木栓組織，此時表皮外層的角質(zhì)層不斷龜裂剝落，在果實(或塊莖)表面形成了黃褐色、赤褐色周皮組織即果銹[8-9,12-17]。果銹的發(fā)生，在幼果期(金冠蘋果，花后2周)即開始，此后的2～6周是果銹形成的關鍵時期[9,17]。從生理學角度分析，苯丙烷類代謝、乙烯代謝及次生代謝等多種途徑都與果銹的形成有關，并且木質(zhì)素生物合成、多胺及過氧化氫的信號傳遞可對果銹的形成進行調(diào)控[18-19]。

果銹基因主要包括表皮物質(zhì)合成基因和脅迫應答基因2大類，根據(jù)功能的不同表皮物質(zhì)合成基因可進一步分為表皮生物合成基因、木栓質(zhì)沉積基因。在梨果銹形成過程中，表皮生物合成基因隨著脅迫應答基因、木栓質(zhì)沉積基因的急劇增加而受到抑制[11,20]。在蘋果多銹品種中，一些編碼纖維素合成酶6、木聚糖合成酶、果膠甲基酯酶的基因表現(xiàn)出了上調(diào)表達，與木栓質(zhì)相關的苯丙烷類代謝調(diào)控基因的差異表達，其中的轉(zhuǎn)錄因子MdMYB93在木栓質(zhì)的累積過程中發(fā)揮主要作用[11,21]。在碭山酥梨的銹變單株中檢測到10個ABC家族的銹變差異表達基因，這些基因參與了銹變果實木栓化的形成[22]。

果銹基因的遺傳機制極為復雜。在梨上，果銹基因是受2對基因控制，其中的R1/r1基因的SSR標記CH01c06和Hi20b03，遺傳距離分別為 4.8，12.0 cM，推測該基因可能位于梨的LG8上[7]，也有學者認為，果銹屬于質(zhì)量性狀，而果銹含量則為數(shù)量性狀，兩者分別受不同的遺傳位點控制[20]。在蘋果上，果銹的遺傳力中等，通常在0.34～0.54[23-24]；近年來獲得了1個控制Renetta Grigia di Torriana銹變的主效基因，它位于蘋果的LG12染色體上[25]，然而，關于果銹基因的分子遺傳機制尚不清楚。2015年在宮崎短枝富士(MYS)×坂田津輕(SKT)的雜種分離群體中發(fā)現(xiàn)了全銹的子代單株，通過3 a觀察該株子代表現(xiàn)穩(wěn)定。本研究以該群體的子代植株為試材，采用SLAF技術開發(fā)標簽并構(gòu)建圖譜，結(jié)合表型數(shù)據(jù)分析，對蘋果果銹基因進行遺傳定位，以期找到控制蘋果果銹的遺傳位點，為無銹蘋果或免套袋蘋果品種的選育及利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2003年以宮崎短枝富士為母本，坂田津輕為父本雜交，2004年播種雜交種子，2010年轉(zhuǎn)接于SH6中間砧砧木上，進行常規(guī)的果園管理。進入結(jié)果期后，在該分離群體中發(fā)現(xiàn)了全銹蘋果變異株(圖1)。

1.全果銹蘋果(成熟期)；2.全果銹蘋果(幼果期)；3.對照。1. Full russeting apple at ripen stage; 2.Russeting in young fruits;3.Control.

1.2 試驗方法

采集宮崎短枝富士×坂田津輕雜種分離群體中的150株子代及雙親的蘋果葉片，采用CTAB法分別提取基因組DNA后，運用SLAF-seq 技術(Specific-locus amplified fragment sequencing)和HighMap 軟件進行高密度分子標簽開發(fā)，構(gòu)建高密度遺傳圖譜，然后對果銹基因進行QTL定位。

1.2.1 表型調(diào)查 參照Durel等[23]的方法，稍有改進，設4級：0級無或沒有見到；1級果面有少量果銹(少于1/3)，2級果面有大量果銹(介于1/3和1/2之間)；3級果面銹量1/2以上。2015-2017年連續(xù)3 a對雜種分離后代果面果銹情況進行調(diào)查。

1.2.2 酶切方案設計及測序 根據(jù)蘋果(MalusdomesticaBorkh.)基因組大小以及 GC 含量等信息進行酶切預測。選擇RsaⅠ 和HaeⅢ 酶切組合，酶切片段長度在 364～464 bp 的序列定義為 SLAF標簽，預測可得到 123 512 個 SLAF 標簽。根據(jù)最適酶切方案，對檢測合格的各樣品基因組 DNA 分別進行酶切。得到的酶切片段(SLAF 標簽)進行 3′端加 A 處理、連接 Dual-index[26]測序接頭、PCR 擴增、純化、混樣、切膠選取目的片段，文庫質(zhì)檢合格后用IlluminaHiSeqTM 進行 PE125bp 測序。

1.2.3 SNP開發(fā)及編碼 根據(jù) Clean Reads 在參考基因組的定位結(jié)果，使用 Picard 進行去重復、GATK 進行局部重比對、堿基質(zhì)量值校正等預處理，以保證檢測得到的單核苷酸多態(tài)性(SNP)準確性，再使用 GATK 進行SNP的檢測，過濾，并得到最終的 SNP 位點集。根據(jù)遺傳學通用的等位編碼規(guī)則對多態(tài)性標簽進行基因型編碼。

1.2.4 圖譜構(gòu)建 為保證遺傳圖譜質(zhì)量，將多態(tài)性 SLAF 標簽進行過濾：過濾掉父母本測序深度 4×以下的標簽；對于單一多態(tài)性標記位點，選擇100 個子代中至少有 70 個個體有確定基因型的標記；用偏分離標記處理方法過濾嚴重偏分離(卡方檢驗P<0.001)的多態(tài)性標記。

將篩選獲得的標記，通過計算兩兩標簽之間MLOD 值[27]，過濾掉與其中SLAF標簽的MLOD值低于 3 的標簽，將標簽分到 17 個群。以連鎖群為單位，采用 HighMap 軟件分析將獲得連鎖群內(nèi) Marker 的線性排列，并估算相鄰 Marker間的遺傳距離。

1.2.5 QTL分析 基于表型數(shù)據(jù)值，采用mapqtl方法對果銹基因進行QTL分析，LOD閾值為3.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計與評估

利用Hiseq2500平臺進行SLAF-seq文庫的測序分析。結(jié)果表明，測序獲得了 110 321 714 552 bp數(shù)據(jù)，測序平均 Q30 為 95.07%，平均 GC 含量為 40.11%，樣本 GC 分布正常。宮崎短枝富士和坂田津輕分別獲得29 944 687 reads (8 972 246 842 bp)、29 251 169 reads(8 763 175 910 bp)數(shù)據(jù)，測序平均Q30為 93.68%，93.86%，平均GC含量為 38.36%，38.30%；子代群體獲得了3 086 176 reads，617 235 279 bp數(shù)據(jù)，測序平均Q30為 95.09%，平均GC含量為 40.14%；各樣本GC分布正常(表1)。

表1 樣品測序數(shù)量Tab.1 Quantity of sequencing sample

2.2 建庫評估

將測序獲得的231 821 reads，通過 SOAP軟件[28]對 Control 的測序 reads 與參考基因組進行比對。結(jié)果表明，Control數(shù)據(jù)的建庫雙端比對效率在89.17%，酶切效率為88.41%，SLAF建庫正常。

2.3 標記開發(fā)

使用 GATK 軟件工具包分別對親本和子代的數(shù)據(jù)進行比對和SNP開發(fā)。結(jié)果顯示，宮崎短枝富士和坂田津輕分別開發(fā)了4 669 811，4 951 676個SNP標簽，雜合比率為69.35%和81.65%。子代群體開發(fā)了1 116 418個標簽，雜合比率為10.83%(表2)。同時，還開發(fā)了SLAF 20 440個，平均測序總深度為2 538 482 cM，平均測序深度為12.01 cM。

表2 測序數(shù)據(jù)比對和SNP統(tǒng)計Tab.2 Comparison of sequencing data and SNP

開發(fā)的SNP標記中非 aa×bb 標簽的數(shù)目為 3 989 143個，占總開發(fā)的 SNP 數(shù)目的 54.50%(表3)。

2.4 遺傳圖譜構(gòu)建

過濾篩選后的標記根據(jù)MLOD值進行連鎖群的劃分，所有標簽分別歸為17個群繪制連鎖群。然后以連鎖群為單位，采用Highmap將群內(nèi)標記進行線性排列，共獲得上圖標記4 075個，總圖距為2 235.23 cM(圖2)。

表3 SNP的分類統(tǒng)計Tab.3 Statistic of SNP Marker

圖2 宮崎短枝富士×坂田津輕雜種分離群體的遺傳圖譜Fig.2 Genetic map constructed with a population derived from Miyazaki Spur×Sakata Tsugaru

2.5 遺傳圖譜評估

構(gòu)建的中性遺傳圖譜，將4 075個標記定位在17個連鎖群上，每個連鎖群平均包括240個標記，2個標記的平均圖距在0.55 cM(表4)。上圖標記中包含了256個偏分離標記，占標記總數(shù)的比例為6.28%。

表4 分子標記及偏分離標記位點在連鎖群上的分布Tab.4 Basic characteristics of Malus linkage groups in the cross of between Miyazaki Spur and Sakata Tsugaru

對作圖群體每個個體上圖標記完整性分析發(fā)現(xiàn)，上圖標記的完整度平均為 99.92%，圖譜基因分型準確。將上圖標記在基因組上的位置和遺傳圖譜進行共線性分析發(fā)現(xiàn)，各個連鎖群上大部分標記的順序與基因組保持一致，說明共線性較好，遺傳重組率的計算準確度高。

2.6 QTL分析

連續(xù)3 a的田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在調(diào)查的150株中，8株無明顯果銹，占調(diào)查數(shù)的5.3%，22株果銹量為1級，占調(diào)查數(shù)的14.7%，44株果銹量為2級，占調(diào)查數(shù)的29.3%，還有76株的銹含量在年份間差異較大。經(jīng)mapqtl分析，共檢測到控制蘋果果銹的9個QTL，分布在Chr3、Chr9、Chr11和Chr15染色體上(圖3)，標記距離為0～4.9 cM，分別將這些QTL命名為Qru-3、Qru-9、Qru-11和Qru-15(圖4)，單個QTL的貢獻率為18.0%～85.5%(表5)。其中，Qru-9、Qru-15和Qru-3的貢獻率較高(分別為85.5%，24.3%～47.8%和46.1%)，可能是控制蘋果果銹的關鍵作用位點。

圖3 果銹基因的QTL檢測Fig.3 QTL analysis of apple russeting gene

圖4 利用宮崎短枝富士和坂田津輕雜種分離群體檢測到果銹基因的QTLFig.4 QTL for apple russeting in a population derived from a cross between Miyazaki Spur and Sakata Tsugaru

染色體Linkage group ID位置/cMLocation標記MarkerLOD貢獻率/%PVE Chr11101.79Marker2531723.7222.0Chr11101.79Marker2562423.7421.8Chr11105.53Marker2570593.0318.0Chr1516.01Marker9755194.3524.3Chr1516.01Marker9792184.8147.8Chr1516.01Marker9755204.8147.8Chr1520.91Marker9792194.0647.1Chr3123.42Marker24224813.0446.1Chr9107.61Marker35875255.9085.5

對標記區(qū)域進行進一步基因注釋，注釋到127個基因，該4個染色體各包括61，64，1，1個基因。GO注釋結(jié)果可知，它們在細胞組分、分子功能及生理代謝方面發(fā)揮作用，其中Qru-11、Qru-15所攜帶信息更多一些，是今后研究的重點(表6)。

表6 標記區(qū)域的基因注釋Tab.6 Annotation of the marked regions of apple russeting gene

3 結(jié)論與討論

SLAF-seq技術是利用二代高通量測序發(fā)展而來的一套簡化基因組測序技術。根據(jù)參考基因組信息，通過特定內(nèi)切酶酶切基因組并篩選特定大小的片段建庫測序，從而選擇性地得到目標基因組的片段序列。目前，基于 SLAF-seq 的分子標記技術已經(jīng)在黃瓜[29]、葡萄[30]、木薯[31]、石槲蘭[32]、玉米[33-34]等植物中得到應用。本研究利用該技術開發(fā)SLAF標簽20 440個，SNP標記位點7 309 729個，這些信息位點為蘋果相關基因的定位和分子輔助育種研究奠定了基礎。

以往研究表明，蘋果果銹受氣候、病菌等因素的影響，蘋果果銹的遺傳力中等[23-24]，而該基因的大小及所在的位置尚不清楚。近年來，隨著高通量測序技術的發(fā)展，為性狀的遺傳分析提供了強大的技術支持[35]。Falginella等[25]將Ru-RGT定位在LG12上400 bp的基因片段上，進一步分析還發(fā)現(xiàn)，嘎拉蘋果上也擁有該基因位點，但是桔蘋等一些多銹品種沒有檢測到。因此，果銹基因的遺傳機制更為復雜，為進一步發(fā)掘新的果銹基因，本研究在開發(fā)標記的基礎上，進行遺傳圖譜的構(gòu)建并結(jié)合3 a的表型數(shù)據(jù)，新獲得了9個果銹相關QTL，分布于Chr3、Chr9、Chr11和 Chr15上，在這些區(qū)段內(nèi)共注釋到127個基因，它們在細胞組分、分子功能及生理代謝方面發(fā)揮作用。參照RNA混池重測序技術發(fā)現(xiàn)的206個參與細胞構(gòu)建、生物代謝等過程的差異表達基因[2]，進行對比分析、驗證，有助于果銹基因的分子調(diào)控機制深入揭示。

一直以來，蘋果果銹基因被作為不利性狀來看待[8-14]，不過最近在默頓和皇家嘎拉蘋果的果銹組織上檢測到樺木酸-3-反式-咖啡酸酯等3種三萜烯-咖啡酸酯，它們都具有獨特的免疫調(diào)節(jié)活性[1]，為果銹基因的開發(fā)利用提供了新思路。多年來的觀察發(fā)現(xiàn)，果面銹含量多的果肉更脆，本研究群體中發(fā)現(xiàn)的全銹株即是如此，但是果實肉質(zhì)是與果銹基因連鎖，還是因受果銹相關代謝活動的直接影響所致，具體原因有待進一步研究。