張梅娟，徐紅紅，馬天意，錢朋智，沙 偉

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學 食品科學與工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

植物的生長和發(fā)育離不開水分的運輸，將體內水勢維持在一個合適的水平尤為重要。水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是一種定位于細胞膜上的蛋白質，可以調節(jié)水分高效快速、可逆地跨膜轉運，從而調控植物體內水分的平衡。AQP為主要內在的膜鑲嵌蛋白超基因家族(Major Intrinsic proteins，MIPs)中的一員，廣泛存在于動植物和微生物中。植物中AQP的類型豐富多樣且表達豐度極高[1]，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有35個水通道蛋白成員[2]，玉米(Zeamays)中有36個[3]，水稻(Oryzasativa)中有33個[4]，葡萄(Vitisvinifera)中有33個[5]，番茄(Solanumlycopersicum)中有37個[6]，陸地棉(Gossypiumhirsutum)中有71個[7]，大豆(Glycinemax)中有66個[8]，芝麻(Sesamumindicum)中有35個[9]。根據(jù)序列相似性和亞細胞定位，AQP被分為7類，分別是質膜內在蛋白(Plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)，液泡膜內在蛋白(Tonoplast intrinsic proteins, TIPs)，類Nodulin26內在蛋白(Nodulin26-like intrinsic proteins, NIPs)，小分子堿性膜內在蛋白(Small basic intrinsic proteins, SIPs)，類GlpF內在蛋白(Glycerol facilitator intrinsic proteins, GIPs)，混合類內在蛋白(Hybrid intrinsic proteins, HIPs)和未知類X內在蛋白(Uncategorized X basic intrinsic proteins, XIPs)[2, 10-12]。其中，GIPs 發(fā)現(xiàn)于小立碗蘚(Physcomitrellapatens)中，HIPs發(fā)現(xiàn)于球蒴蘚(Sphaerotheciellasphaerocarpa)中，XIPs在馬鈴薯(Solanumtuberosum)、煙草(Nicotianatabacum)和小立碗蘚中被發(fā)現(xiàn)，并不常見，相關研究較少。

PIPs是MIPs中最大的亞家族，分為PIP1s和PIP2s 2個亞類，是一類多功能蛋白質，對運輸機制有高度選擇性[13]。PIPs分子質量約24～30 ku，有6個跨膜結構域，5個親水環(huán)(loop A～E)。其中A、C、E環(huán)位于細胞膜外，B、D環(huán)及氨基端和羧基末端均位于細胞質一側；在B、E環(huán)上各有一個高度保守的天門冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸(NPA)小結構域[14-15]。PIP1s與PIP2s的主要區(qū)別在于N端和C端的不同，PIP1s有較長的N端和較短的C端，PIP2s則相反[16-17]。PIP2s具有較高的水分滲透性，PIP1s水分運輸能力弱，說明PIP2s在脅迫條件下受到異位蛋白影響比PIP1s大，但二者均能參與植物的生長和發(fā)育[14]。許多研究表明，植物能夠通過調節(jié)PIPs的活性響應各種非生物脅迫，如干旱、高溫、鹽害、滲透脅迫等[18-19]。例如，在擬南芥中過表達巴西香蕉(Musaacuminata)中的MaPIP1;1基因，在干旱和高鹽脅迫條件下，轉基因植株的抗性顯著提高，且轉基因株系的根系增長，根毛增多[20]。馬尾松(Pinusmassoniana)的PmPIP1基因可受干旱脅迫誘導表達，推測可能參與了干旱脅迫過程[21]。高羊茅(Festucaarundinacea)基因FaPIP2;1在擬南芥中過表達，轉基因植株的抗旱性明顯增強[22]?；颐珵I藜(Atriplexcanescens)中AcPIP2基因過表達擬南芥，能夠調控轉基因植株對干旱、高鹽和低溫等脅迫的抵抗力[23]。由此可見，PIPs 在植物抵御非生物脅迫過程中具有非常重要的作用。目前，砂蘚(Racomitiumcanescens)水通道蛋白PIPs基因克隆和功能分析的相關研究未見報道。因此，為更好地了解苔蘚植物的抗干旱機理，本研究對砂蘚水通道蛋白PIPs基因進行克隆，對其編碼蛋白進行結構預測，為苔蘚植物抗旱基因工程研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

砂蘚采于黑龍江省五大連池風景區(qū)石龍。選取生長旺盛的材料，用無菌水清洗后，于室溫中培養(yǎng)，取莖尖部分放于液氮中速凍，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取 采用沙偉等[24]的改良SDS法進行砂蘚總RNA的提取。

1.2.2RcPIP2的克隆 從砂蘚干旱轉錄組測序數(shù)據(jù)庫中篩選得到1個PIPs家族基因PIP2的轉錄本序列，根據(jù)其序列設計1對引物R1(5′-GAGGCGG CTTCGTAGGTTA-3′)和R2(5′-GCACAGCGACCTA CATACAAGA-3′)，擴增基因PIP2全長序列，并命名為RcPIP2基因。將PCR擴增產物進行回收、連接、轉化和雙酶切鑒定。對已鑒定的陽性克隆送至北京華大基因進行測序。

1.2.3 生物信息學分析 運用ProtParam軟件預測該基因的基本理化性質；通過ProtScale和TMHMM軟件預測基因RcPIP2編碼的氨基酸序列的親疏水性、跨膜結構域；利用SignalP 4.1和SOPMA軟件對氨基酸序列的信號肽和二級結構進行預測；氨基酸序列立體結構預測由SWISS-MODEL軟件完成。將氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的BlastX進行同源性搜索和比對，利用MEGA 5.0軟件分析RcPIP2蛋白質與其他植物的PIP2蛋白質的進化關系，構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 RcPIP2基因 cDNA 全長的克隆

以砂蘚反轉錄cDNA為模板，以干旱轉錄組數(shù)據(jù)為基礎，對PIP2進行擴增，得到的目的片段長度約1 200 bp(圖1-A)?；厥漳康钠闻c克隆載體相連，得到重組質粒pMD19 simple T-PIP2，將其轉化到大腸桿菌感受態(tài)細胞中。經(jīng)藍白斑篩選出陽性克隆菌落，提取質粒DNA進行雙酶切鑒定，結果與目的片段大小相吻合，說明重組質粒構建成功(圖1-B)。測序結果顯示，PIP2基因全長為1 267 bp，ORF長807 bp，共編碼含有268個氨基酸的蛋白質序列，與轉錄組測序結果一致(圖2)。對該片段的測序結果表明，這是首次從砂蘚中克隆獲得的PIP2基因家族成員，因此，命名為RcPIP2基因。

M.DL2000 DNA Marker。

ATG.起始密碼子；TAG.終止密碼子；單下劃線. 高度保守序列；黑框. 高度保守天門冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸Asn-Pro-Ala (NPA)。ATG.Initiator codon; TAG.Terminator codon; Single underline.Highly conserved sequence; Black box.Conserved Asn-Pro-Ala (NPA).

2.2 生物信息學分析

2.2.1 RcPIP2蛋白質理化性質及親疏水性分析RcPIP2基因編碼的氨基酸序列中，相對含量比較多的氨基酸是丙氨酸Ala(A)和甘氨酸Gly(G)，分別為12.9%，9.3%，氨基酸組成見表1。

通過ProtParam軟件預測RcPIP2蛋白質的分子質量(Mr)為28.3 ku，理論等電點(pI)為6.64，其中負電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)為15，正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)為14，為中性蛋白質；不穩(wěn)定系數(shù)為21.61<40，表示該蛋白質為穩(wěn)定性蛋白質；脂肪系數(shù)為102.39，表示該蛋白質中脂肪側鏈所占的比值較大，推測疏水性較強。ProtScale軟件可分析蛋白質疏水曲線，其中正值表示疏水，負值表示親水，疏水性較高的肽段位于蛋白質的內部，親水性較高的肽段位于蛋白質分子的表面(圖3)。圖3結果顯示，RcPIP2蛋白質符合膜蛋白的特征，具有較強的疏水性。

表1 RcPIP2蛋白質的氨基酸組成

Tab.1 The amino acid composition of RcPIP2 protein%

氨基酸Amino acid比例Proportion 氨基酸Amino acid比例Proportion Ala (A)12.9Lys (K)1.5Arg (R)4.5Met (M)3.3Asn (N)3.6Phe (F)5.1Asp (D)2.1Pro (P)5.4Cys (C)2.4Ser (S)5.7Gln (Q)2.7Thr (T)6.3Glu (E)3.9Trp (W)1.5Gly (G)9.3Tyr (Y)3.3His (H)2.4Val (V)6.9Ile (I)8.1Pyl (O)0.0Leu (L)9.0Sec (U)0.0

2.2.2 RcPIP2蛋白質結構域分析 利用NCBI中Conserved Domains在線軟件分析保守結構域發(fā)現(xiàn)，RcPIP2具有膜內在蛋白(MIP)家族信號序列，屬于MIP超家族成員(圖4)。該結構域具有高等植物高度保守序列HINPAVTFG，且在氨基酸的C端和N端包含2個特有的高度保守的天門冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸Asn-Pro-Ala (NPA)結構單元(圖2)。

圖3 RcPIP2蛋白質疏水性分析Fig.3 Hydrophobicity analysis of RcPIP2

圖4 RcPIP2蛋白質的保守結構域Fig.4 Conserved domains of RcPIP2 protein

2.2.3 RcPIP2蛋白質信號肽和和跨膜結構域分析 利用SignalP 4.1軟件進行信號肽預測發(fā)現(xiàn)，RcPIP2不存在信號肽，推測為非分泌蛋白質。利用TMHMM軟件對RcPIP2跨膜區(qū)分析顯示，膜螺旋中氨基酸期望值高達134.158 97，存在6個可能的跨膜區(qū)域(TM1-TM6)，其中37-59，110-132，86-208位氨基酸均是由內向外跨膜；69-91，152-174，234-256位氨基酸均是由外向內跨膜，且N端和C端都位于膜的內側(圖 5)。

圖5 RcPIP2蛋白質跨膜區(qū)預測Fig.5 Prediction of transmembrane domains of RcPIP2 protein

2.2.4 RcPIP2蛋白質二級和三級結構預測 采用SOMPA預測二級結構顯示，RcPIP2蛋白質擁有α螺旋(h)80個，占總數(shù)的37.31%；β折疊(e)64個，占總數(shù)的20.9%；無規(guī)則卷曲(c)148個，占總數(shù)的38.43%(圖 6)。

藍. α-螺旋；紫. 無規(guī)則卷曲；紅. 延伸鏈；綠. β-轉角。Blue.Alpha helix; Purple.Random coil; Red.Extended strand; Green.Beta turn.

利用SWISS-MODEL對RcPIP2氨基酸三級結構進行在線預測發(fā)現(xiàn)，RcPIP2蛋白質的立體結構與水通道蛋白的高級結構基本一致，由水通道蛋白分子組成四聚體，其中每一個亞基都有一個通道，這4個亞基平行分布，在四聚體中間形成第5個通道(圖 7)。

2.2.5 RcPIP2蛋白質一致性比對及系統(tǒng)進化樹分析 利用NCBI的Blast軟件進行RcPIP2基因編碼氨基酸序列的同源性查找，結果發(fā)現(xiàn)，RcPIP2蛋白質與其他物種的PIP2蛋白質相似性較高，與擬南芥(NP_191042.1)、小立碗蘚(AAS65964.1)、玉米(NP_001105616.1)、煙草(NP_001312276.1)、陸地棉(NP_001314334.1)、地錢(PTQ40096.1)、高粱(XP_002446796.1)、大豆(XP_003556232.1)、二穗短柄草(XP_003580150.1)、谷子(XP_004953172.1)和水稻(XP_015645289.1)等物種中的PIP2蛋白質的相似性均在66%以上。其中，與小立碗蘚的一致性最高，為67%，這說明在長期的進化中，PIP2基因的結構也在進化，但是相對保守。

利用MEGA 5.0軟件構建系統(tǒng)進化樹，結果表明，以上物種被聚為兩大支，其中砂蘚、小立碗蘚和地錢親緣關系最近，聚為一支(圖8)。

圖7 RcPIP2蛋白質三級結構預測Fig.7 Predicted tertiary structure of RcPIP2 protein

分支上的數(shù)字表示Bootstrap驗證中基于1 000次重復該節(jié)點可信度。The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstraps values based on 1 000 replications.

3 結論與討論

植物中的水分經(jīng)過長距離運輸，利用擴展和滲透調節(jié)的方式進入單個細胞，在整個過程中都離不開水分的跨膜運輸。而植物水通道蛋白介導的自由水快速被動地跨生物膜轉運便構成了植物體水進出細胞的主要途徑。砂蘚可以經(jīng)歷長期的干旱脅迫，復水后仍能快速地恢復正常生長，說明其具有獨特的耐旱、抗旱機制[25]。本研究成功擴增出砂蘚水通道蛋白RcPIP2基因序列。研究發(fā)現(xiàn)，RcPIP2蛋白屬于MIP超家族，具有保守的HINPAVTFG氨基酸序列，6個跨膜結構域，存在2個特異保守區(qū)(NPA)，分別深入到脂質雙層的內部，呈中心反向相對排列，可在膜雙脂層中間重疊成2個半孔，形成一個狹窄的水通道，允許水分子通過。NPA是水通道蛋白的特異性保守序列，幾乎所有的MIP均具有此結構域。因此，本研究所獲得的RcPIP2基因基本可確定為水通道蛋白家族成員。

利用生物信息學相關軟件對砂蘚水通道蛋白RcPIP2編碼氨基酸的特性進行分析可知，該蛋白質為中性蛋白質，無信號肽區(qū)域，說明為非分泌性蛋白質，且并不缺乏結構區(qū)域。RcPIP2蛋白質共由80個α螺旋、64個β折疊和148個無規(guī)則卷曲構成。通過其立體結構可以看出，該蛋白質為四聚體形式，中間為高度保守的NPA基序組成的水通道，與水通道蛋白質的基本結構相吻合。系統(tǒng)進化樹分析表明，砂蘚、小立碗蘚和地錢均為苔蘚植物中的成員，而RcPIP2與二者的親緣關系最近，處于同一進化枝，進一步推測本研究中所得的RcPIP2是PIP2蛋白質家族中的一員，研究結果可為后續(xù)進一步研究其功能提供重要的基礎數(shù)據(jù)，并最終為苔蘚植物的耐旱機制研究提供理論依據(jù)。

目前對植物水通道蛋白的結構、功能及其調節(jié)機制還知之甚少，真正揭開植物水通道蛋白在植物生命活動的分子機理中的作用所面臨的任務還十分艱巨[26]。對抗旱植物水通道蛋白分子水平的研究還需要進一步的深入探索。