馬 麗， 沈蔡慰， 陳 瑞， 吳玉環(huán)， 崔樂怡，陶 濤， 張婷婷， 朱葉心怡, 劉 鵬

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004；2.杭州師范大學 生命與環(huán)境科學學院，浙江 杭州 310036)

0 引 言

栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)是中國廣泛種植的多年生攀援草本植物，從果實中提取的葫蘆素D可用于開發(fā)抗腫瘤藥物，塊根可用于糖尿病的治療[1].鋁毒是制約全球酸性土壤地區(qū)農業(yè)生產的關鍵因素，全世界約50%的潛在耕地因土壤酸化引起的鋁浸出而不能有效地發(fā)展為農業(yè)耕地[2].植物的根長及根系活力在鋁脅迫下受到抑制，可以作為衡量植株是否遭受毒害的特征[3].根是植物生長發(fā)育過程中吸收營養(yǎng)和水分的器官，通常會分泌一些物質來幫助植株在逆境中更好地生存，這些物質被統(tǒng)稱為根系分泌物，適量根系分泌物能夠去除或中和土壤中的有毒物質，但分泌過多會產生自毒效應，從而造成雙重脅迫[4].

細胞壁是植物細胞最外層的保護結構，細胞壁成分會隨著外界環(huán)境條件的變化發(fā)生調整，成為抵抗外界不利環(huán)境的屏障.Baldwin等[5]探究低溫脅迫下豌豆(PisumsativumL.)細胞壁代謝過程時發(fā)現，果膠含量及其甲酯化程度在脅迫下增加，從而減輕低溫對植株的傷害.Fernandes等[6]采用紅外光譜技術分析葡萄(VitisviniferaL.)愈傷組織細胞壁化學成分在礦質營養(yǎng)脅迫下的變化，發(fā)現長時間的脅迫會使植物細胞壁官能團的吸收峰發(fā)生明顯的位移.因此，細胞壁成分及官能團變化對逆境下的植物來說是一個重要指標.目前有關鋁脅迫與根系分泌物關系的探究主要側重于鋁毒對根系分泌物成分的改變[7]，而有關根系分泌物對鋁脅迫下栝樓根際生長特性及細胞壁官能團的影響仍未見報道.研究以2種耐鋁性有差異的栝樓為材料，通過解析根長、生物量、根系活力及細胞壁紅外吸收光譜的變化，總結不同濃度根系分泌物對鋁脅迫下根生長特性和細胞壁官能團的影響，推動鋁毒機理研究，同時尋找能夠有效緩解鋁脅迫的途徑，為栝樓在紅壤地區(qū)的大面積種植和推廣奠定基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗室收集大量來自不同地區(qū)的栝樓種子，經ISSR遺傳多樣性分析和鋁處理后篩選，得到親緣關系較遠且耐鋁性差異較大的河北安國栝樓和浙江浦江栝樓作為實驗材料[8]，其中河北安國栝樓耐鋁性較強，而浙江浦江栝樓對鋁敏感.

1.2 根系分泌物的收集

栝樓種子在砂床中萌發(fā)，選取長勢良好且株高為15 cm的2種栝樓幼苗各40株，洗凈根部后分別置于盛有8 L蒸餾水的塑料桶中培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)液經真空旋轉蒸發(fā)儀濃縮至500 mL，得到2種栝樓的根系分泌物置于-20 ℃冰箱中冷藏備用(根系分泌物成分可參考文獻[9]).

1.3 材料處理

另取同期萌發(fā)且株高為15 cm的2種栝樓幼苗各54株，轉移至裝有5 kg試樣土壤(紅壤，來自浙江師范大學生物園，風干并磨碎過100目篩后使用)的塑料盆中，每盆3株，于恒溫25 ℃，濕度75%，光照16 h，黑暗8 h的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng).3 d后用AlCl3及根系分泌物對幼苗進行處理，其中鋁處理設300，800 μmol/L 2個濃度，每盆添加AlCl3溶液50 mL，根系分泌物與鋁處理同時進行，在鋁處理的基礎上設置4個處理組，分別添加根系分泌物0，20，30，60 mL，除上述8組外另設空白對照組CK，2種栝樓的9個處理組分別編號CK,Y300-0,Y300-20,Y300-30,Y300-60,Y800-0,Y800-20,Y800-30,Y800-60，每組6個重復，在處理7，14，21 d后，測定栝樓根部的各個生理指標.

1.4 生物量及根系活力的測定

將根剪下并洗凈，用吸水紙吸干根表面水分并用分析天平測得根鮮重數據，隨后將根放入稱量瓶中，105 ℃烘干至恒重后稱量得到根干重[10].根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[11]：將根洗凈后，稱取0.3 g根尖置于試管中，加入0.4%TTC和H3PO4緩沖液(pH 7.5)各5 mL，37 ℃反應3 h，加入2 mol/L硫酸2 mL終止反應；將根取出并吸干水分，同3 mL乙酸乙酯及少量石英砂一起置于研缽中研磨，溶解后倒入10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯定容后靜置至完全沉淀，取濾液于485 nm處比色，記錄吸光度，查標準曲線得轉鐵蛋白(TRF)含量.

1.5 細胞壁官能團分析

剪取30個栝樓根尖，用0.5 mmol/L CaCl2清洗后蒸餾水洗滌2次，加入0.5 mL蒸餾水低溫下進行研磨，研磨后10 000 r/min離心10 min，沉淀用1 mL 80%乙醇洗2次，用V甲醇/V氯仿=1/1混合溶液清洗一次，最后用1 mL丙酮清洗一次，沉淀進行冷凍干燥后得到細胞壁[12].取1 mg細胞壁，采用NEXUS 670傅立葉紅外光譜儀(美國Nicolet公司)對細胞壁官能團進行分析.

1.6 數據處理

實驗數據錄入Excel 2010進行整理，數據通過SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析.用Origin 9.0軟件繪制紅外光譜圖，并用Omnic 9.0軟件進行數據分析.

2 結果分析

2.1 鋁脅迫下根系分泌物對栝樓根系活力及根生物量的影響

通過對比安國栝樓3個周期中CK組與Y300-0,Y800-0的根長差異(見表1)，可以看到鋁處理抑制根的伸長且高濃度鋁的作用效果更加顯著，7 d時Y300-0組最長根長為CK組的69.7%，Y800-0組則為CK的64.7%，14 d時Y300-0,Y800-0組的根長分別為CK組的64.4%和46.6%，21 d時為57.0%和42.6%，因此鋁處理濃度與根伸長的抑制程度正相關.在添加根系分泌物后下安國栝樓的根長增加，在30 mL時根長達到最大值，但用量達到60 mL時根長降至CK組以下，7 d時Y300-20組的最長根長為Y300-0的1.7倍，CK組的1.2倍，Y300-30組的最長根長則達到了Y300-0的2.2倍，CK組的1.5倍，Y300-60組的根長則降至Y300-0的83.8%，CK組的58.5%，該結果表明，高濃度的根系分泌物并未對根長起促進作用，反而進一步抑制了根的伸長.

從表1中可以發(fā)現，根鮮重與干重的比值始終維持在10倍左右，且安國栝樓根鮮重、干重變化趨勢與根長趨勢一致，7 d時Y300-0組的根鮮重降至CK組的32.0%，Y300-20組的根鮮重為Y300-0的 3.3倍，CK組的1.1倍，Y300-30組的根鮮重為Y300-0的4.0倍，CK組的1.3倍，但Y300-60組的根鮮重卻降至Y300-0的1.8倍，CK組的57.2%，鮮重仍在30 mL根系分泌物施用時達到最大，在60 mL處降至CK以下.另外，安國栝樓根系活力的改變也符合這一趨勢，根中所測的各個指標存在相關性，通過分析各指標的變化趨勢，表明鋁脅迫下低濃度根系分泌物促進栝樓根部生長，高濃度根系分泌物抑制生長.

浦江栝樓4個指標的變化趨勢與安國栝樓一致，但通過數據分析可確定二者的耐鋁性存在差異.浦江栝樓與安國栝樓CK組的長勢在14 d時最為接近，此時安國栝樓Y300-0組的鮮重為CK的31.8%，浦江栝樓Y300-0組的鮮重為CK的33.1%，表明300 μmol/L鋁處理對2種栝樓的脅迫效果較為接近，但當鋁處理濃度達到800 μmol/L時，安國栝樓Y800-0的鮮重為CK的36.8%，在浦江栝樓中卻達到了19.0%.因此，高濃度鋁脅迫對浦江栝樓的生長抑制作用強于安國栝樓.

2.2 鋁脅迫下根系分泌物對栝樓根系細胞壁官能團的影響

2.2.1 不同處理下栝樓細胞壁紅外光譜圖

圖1和圖2中4 000 cm-1～1 330 cm-1是官能團區(qū)，1 330 cm-1～500 cm-1是指紋區(qū).官能團區(qū)中3 285 cm-1左右較寬的吸收峰是-OH伸縮振動峰，2 920 cm-1處是C-H伸縮振動峰，1 640 cm-1附近的吸收峰是蛋白質的C=O伸縮振動峰(酰胺I帶)，1 438 cm-1處的吸收峰是苯環(huán)骨架的伸縮振動峰，1 340 cm-1處的吸收峰是油脂化合物-CH2的彎曲振動峰.指紋區(qū)中1 240 cm-1附近是由蛋白質C-N伸縮振動和N-H的彎曲振動疊加形成的酰胺Ⅲ帶，1 025 cm-1處的譜帶為多糖骨架R-O鍵的振動吸收峰，690 cm-1處出現的吸收峰是N-H面外彎曲振動峰.上述吸收峰的存在表明細胞壁中含有氨基酸、多糖、蛋白質、脂肪、飽和烴和芳香類物質，圖1和圖2中浦江栝樓與安國栝樓的吸收峰種類相同，峰形相似，說明2種栝樓的細胞壁成分和含量相近.各峰中吸光度最高的是多糖骨架R-O振動吸收峰，該峰的峰強代表細胞壁中骨架多糖含量.因此，糖類是栝樓細胞壁最主要的組成物質.

表1 鋁脅迫下根系分泌物對栝樓根系活力及根部生物量的影響

注：表內數字后字母表示不同處理差異(P<0.05).

鋁處理后，R-O振動吸收峰和-OH伸縮振動峰的吸光度變化最為顯著，其他吸收峰的強度并未發(fā)生明顯改變，2類吸收峰的強度在鋁處理后增強，但在根系分泌物添加后受到抑制.安國栝樓b,c,d,e組與a組的峰形基本一致，但f組的R-O振動吸收峰和-OH伸縮振動峰相比a組吸光度有明顯的升高，g,h,i組與f組相比峰強有所降低，其中h組峰形與a組最為接近.浦江栝樓對鋁處理更加敏感，2種栝樓a組的峰形相似，但浦江栝樓f,g,i組的R-O振動吸收峰和-OH伸縮振動峰的峰強明顯高于安國栝樓.以上結果表明，鋁處理使細胞壁多糖含量升高，并增加細胞壁上羥基的數量，根系分泌物能夠抑制鋁對細胞壁成分的改變，當根系分泌物用量達到30 mL時效果最好.另外，浦江栝樓在鋁脅迫下紅外光譜的變化大于安國栝樓，表明浦江栝樓對鋁脅迫更加敏感.

2.2.2 不同處理下栝樓細胞壁官能團及紅外吸收頻率

a:CK;b:Y300-0;c:Y300-20;d:Y300-30;e:Y300-60;f:Y800-0;g:Y800-20;h:Y800-30;i:Y800-60

a:CK;b:Y300-0;c:Y300-20;d:Y300-30;e:Y300-60;f:Y800-0;g:Y800-20;h:Y800-30;i:Y800-60

通過分析表2、表3中數據可知，2 920 cm-1處C-H伸縮振動及1 640 cm-1處酰胺I帶的紅外吸收頻率不變，而其他官能團在處理后吸收頻率發(fā)生明顯變化，因此，這2類官能團與脅迫無關.300 μmol/L鋁處理下，安國栝樓-OH伸縮振動的吸收頻率基本不變，但當鋁處理濃度達到800 μmol/L時，官能團紅外吸收頻率由CK組的3 284 cm-1偏移至Y800-0組的3 328 cm-1處.數據表明,300 μmol/L鋁脅迫處理對該官能團的影響并不顯著，但800 μmol/L鋁脅迫削弱了蛋白質和碳水化合物之間的氫鍵.Y800-20,Y800-30和Y800-60組的紅外吸收頻率分別為3 279 cm-1，3 269 cm-1和3 299 cm-1，該結果表明，根系分泌物能夠緩解鋁脅迫對官能團的損傷.表2中苯環(huán)骨架、-CH2對稱彎曲振動峰、酰胺Ⅲ帶和R-O振動吸收峰有相同的變化趨勢，即紅外吸收僅出現在CK和Y300-302組當中，這些官能團的變化說明，鋁處理破壞了安國栝樓細胞壁上芳香化合物、油脂、蛋白質及多糖物質的結構，而30 mL根系分泌物最有效地緩解了300 μmol/L鋁處理對官能團的損傷，但當鋁處理濃度達到800 μmol/L時，官能團受到的損傷不可逆.

2種栝樓除N-H面外彎曲的其他官能團對鋁脅迫及根系分泌物的響應方式基本相同，但-OH伸縮振動的吸收頻率變化體現了2種栝樓的耐鋁性差異.在300 μmol/L鋁處理后，浦江栝樓-OH伸縮振動峰的吸收頻率由CK組的3 286 cm-1偏移至3 320 cm-1處，而在安國栝樓中該吸收峰則由3 284 cm-1上移至3 288 cm-1，浦江栝樓-OH的偏移幅度更大.另外，浦江栝樓CK組-OH的紅外吸收頻率Y800-0,Y800-30組-OH伸縮振動峰的吸收頻率分別為3 335 cm-1和3 333 cm-1，此時根系分泌物無法緩解-OH吸收頻率的改變，因此,浦江栝樓對鋁毒更加敏感.

表2 安國栝樓細胞壁官能團及其對應的紅外吸收頻率 cm-1

序號官能團CKY300-0Y300-20Y300-30Y300-60Y800-0Y800-20Y800-30Y800-601-OH3 2843 2883 2893 2893 2773 3283 2793 2693 2992C-H2 9222 9212 9242 9242 9232 9222 9222 9232 9223C=O1 6371 6371 6371 6371 6371 6371 6331 6341 6404C==C1 473,1 438,1 4011 4381 4381 473,1 438,1 4021 4301 4211 4381 426-5-CH21 341--1 339-----6C-N,N-H1 239--1 236-----7R-O1 057,1 0271 0251 0251 056,1 0261 0291 0261 0261 0241 0268N-H690--668-----

表3 浦江栝樓細胞壁官能團及其對應的紅外吸收頻率 cm-1

序號官能團CKY300-0Y300-20Y300-30Y300-60Y800-0Y800-20Y800-30Y800-601-OH3 2863 3203 3053 2873 2953 3353 3233 3333 3322C-H2 9212 9212 9252 9242 9232 9182 9222 9212 9203C=O1 6361 6411 6371 6351 6401 6371 6381 6371 6374C==C1 471,1 436,1 4011 4361 4381 471,1 436,1 4021 4331 4371 4251 4281 4325-CH21 378--1 375-----6C-N,N-H1 236--1 236-----7R-O1 054,1 0251 0311 0271 054,1 0271 0301 0281 0281 0271 0288N-H526-535-532-529528529

3 討 論

根長及根系活力是植物在鋁毒環(huán)境中最敏感的2個指標，而生物量的變化則是鋁毒害根部的進一步表現[13].通過對上述生長指標的分析可知，栝樓生長在鋁處理下受到抑制，但在根系分泌物添加后有不同程度的恢復，原因是鋁毒通過阻礙根尖細胞的分裂抑制了根的伸長，而根系分泌物中的有機酸可與鋁離子螯合形成穩(wěn)定結構，從而緩解鋁離子對植株造成的損傷[14].研究結果還體現了高濃度根系分泌物濃度對栝樓生長的抑制作用，Kopittke等[15]在研究根系分泌物對大豆(Glycinemax)鋁脅迫的緩解機制時，同樣發(fā)現了根系分泌物低濃度促進生長，高濃度抑制生長的現象.此類現象的出現可歸因于根系分泌物中化感物質導致的自毒效應，根系分泌物除有機酸外還存在少量酚酸類物質，如苯酚、苯甲醛、肉桂酸等，此類物質濃度過高時會對植株造成毒害[16]，即農業(yè)生產中出現的“連作障礙”，因此,如何避免根系分泌物誘導的自毒效應是后續(xù)需要解決的關鍵問題.

植物細胞壁中富含果膠、纖維素和半纖維素等多糖，其中半纖維素和果膠是Al3+的結合部位[17].Zhu等[18]在水稻中的研究顯示，鋁毒促進水稻(Oryzasativa)細胞壁半纖維素和果膠的合成，研究中2種栝樓的R-O振動吸收峰在鋁處理下升高，證實了鋁毒對細胞壁多糖合成的誘導作用.該結果表明，鋁脅迫可通過改變細胞壁成分從而增加Al3+在細胞壁上的結合位點，從而加強對植株造成的脅迫效果.另外，紅外光譜中-OH伸縮振動峰的峰強在鋁脅迫下提高，細胞壁上羥基的數目增多，Yang等[19]在研究鋁脅迫對水稻的作用時則發(fā)現，鋁脅迫增強果膠甲酯酶的活性，使得半乳糖醛酸的甲酯鍵水解為羧基，羥基和羧基上的氧原子均可與Al3+結合，上述結果表明，鋁毒除改變細胞壁成分以外，還可通過修飾細胞壁物質官能團以增強細胞壁陽離子交換能力，方便Al3+與細胞壁的結合，從而加重植株的鋁毒表型.根系分泌物添加后，R-O振動吸收峰和-OH伸縮振動峰的峰強減弱，說明根系分泌物通過抑制鋁離子活性緩解鋁毒.

鋁處理下2種栝樓多個官能團的紅外吸收頻率發(fā)生變化，張曉斌等[20]發(fā)現鳳眼蓮(Eichhorinacrassipes)根細胞壁上羥基的氧配體可與鎘離子結合，結合時-OH吸收峰向低頻位移，而本實驗中鋁處理使-OH伸縮振動峰向高頻位移.羥基紅外吸收頻率的偏移是由于-OH與Al3+的配位結合，當羥基上的O配體與金屬離子結合時吸收頻率發(fā)生變化，而紅外吸收頻率偏移方向相反是由于2類金屬離子本身的性質差異.另外，鋁處理使苯環(huán)骨架、-CH2對稱彎曲、酰胺Ⅲ帶及多糖骨架R-O鍵的吸收峰發(fā)生變化，說明鋁處理可與細胞壁上芳香化合物、蛋白質、油脂和多糖上的這些基團發(fā)生交換或絡合，因此，后續(xù)研究可從上述幾類物質入手探究鋁脅迫和細胞壁物質的相互作用.