王衛(wèi)平， 戴媛媛， 徐 珂， 張 瑩

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

磺胺二甲氧嘧啶(SDM)是一種用于防治細(xì)菌感染的磺胺類(lèi)藥物，可通過(guò)食物鏈的富集作用累積在體內(nèi)，從而損害人體泌尿和造血系統(tǒng)，產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)[1]．目前報(bào)道的SDM檢測(cè)方法有高效液相色譜法[2]、毛細(xì)管電泳法[3]、電化學(xué)法[4]等，但是這些方法存在操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴、過(guò)程耗時(shí)、選擇性不高等缺點(diǎn)，限制了其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面的應(yīng)用．因此，發(fā)展新型、簡(jiǎn)便、高效的SDM現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法具有重要的意義．

適配體是一類(lèi)通過(guò)指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)篩選得到的功能核酸，它能與靶標(biāo)發(fā)生特異性的結(jié)合，具有易修飾、成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[5]．近年來(lái)，基于納米金(AuNPs)和適配體的新型比色傳感法因其簡(jiǎn)便快速、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于金屬離子[6]和小分子[7-9]的檢測(cè)．倪璇等[8]基于多菌靈適配體和AuNPs構(gòu)建了一種新型比色適配體傳感器，用于水體中殺菌劑多菌靈的檢測(cè)．該比色傳感法具有較低的檢測(cè)限(2.3 nmol/L)和較寬的線(xiàn)性檢測(cè)范圍(2.3～800.0 nmol/L)．Ramezani等[9]設(shè)計(jì)了一種基于三螺旋分子開(kāi)關(guān)和AuNPs的適配體比色傳感器，可用于復(fù)雜樣品如牛奶和血清樣品中四環(huán)素的檢測(cè)，檢測(cè)限低至266 pmol/L．

研究以具有良好的光學(xué)性質(zhì)和生物相容性的AuNPs作為比色傳導(dǎo)信號(hào)元件，具有高選擇特異性的適配體作為傳感探針，通過(guò)優(yōu)化NaCl濃度、適配體濃度及適配體和AuNPs反應(yīng)時(shí)間，構(gòu)建了一種快速檢測(cè)SDM的可視化比色傳感方法．未加入SDM時(shí)，適配體吸附在AuNPs表面，可防止鹽誘導(dǎo)下AuNPs的聚集，溶液為紅色，紫外可見(jiàn)吸收峰在520 nm處．加入SDM后，適配體與SDM發(fā)生特異性結(jié)合，使得適配體從AuNPs表面脫落，導(dǎo)致AuNPs聚集，溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，吸收峰紅移至670 nm處．根據(jù)AuNPs在670 nm 和520 nm處吸光度比值(A670/A520)的變化，可實(shí)現(xiàn)SDM的定量檢測(cè)．為了驗(yàn)證該比色傳感法在實(shí)際樣品中的應(yīng)用性能，將其應(yīng)用于尿樣中SDM的分析檢測(cè)，得到了較高的回收率．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、土霉素(OTC)、環(huán)丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM)購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)；氯化鈉(NaCl)購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司(上海)．氯金酸、檸檬酸鈉、SDM適配體(SBA，序列為：5′-C6-GAGGGCAACGAGTGTTTATAGA-3′[10])均購(gòu)自生工生物工程股份有限公司(上海)．適配體儲(chǔ)備液濃度為4.3 μmol/L．所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水．所有溶液均在4 ℃下避光保存．

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(T9CS型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；透射電子顯微鏡(JEM-2100F，日本電子株式會(huì)社)；電位分析儀(ZS90，馬爾文儀器公司)．

1.2 AuNPs的制備及表征

用于制備AuNPs的玻璃器皿均用新制的王水浸泡處理．AuNPs的制備基于文獻(xiàn)[11]并加以改進(jìn)，具體如下：向三頸燒瓶中加入50.0 mL氯金酸溶液(0.245 mmol/L)，加熱煮沸后，迅速加入3.0 mL檸檬酸鈉溶液(34.3 mmol/L)．當(dāng)溶液呈酒紅色后，繼續(xù)加熱15 min，自然冷卻至室溫，于4 ℃下儲(chǔ)存．

1.3 SDM的測(cè)定

適配體溶液加熱至95 ℃并保持3 min，自然冷卻至室溫．將500 μL AuNPs溶液與300 μL適配體溶液(終濃度為20.0 nmol/L)混合，于25 ℃下振蕩反應(yīng)5 min．加入100 μL不同濃度的SDM溶液，繼續(xù)振蕩反應(yīng)5 min．加入100 μL 1.0 mol/L NaCl溶液，并用磷酸緩沖液稀釋至1.5 mL，靜置2 min后觀察溶液顏色變化．用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描波長(zhǎng)為450～700 nm內(nèi)的吸收光譜，并計(jì)算670 nm 和520 nm 處的吸光度比值(A670/A520)．

1.4 樣品處理

樣品為健康人體空腹晨尿．取2.0 mL尿樣于離心管中，4 000 r/min離心5 min，上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾．取1.0 mL濾液于10 mL棕色容量瓶，用超純水定容，在4 ℃下避光保存．

2 結(jié)果與討論

2.1 比色傳感法檢測(cè)SDM的原理

檸檬酸根包覆的AuNPs由于靜電排斥作用可穩(wěn)定分散于溶液中，在520 nm左右出現(xiàn)最大吸收峰．加入NaCl后，溶液顏色由紅色變?yōu)樽仙了{(lán)色，這是因?yàn)辂}誘導(dǎo)效應(yīng)引起了AuNPs的聚集；此外，由于表面等離子共振效應(yīng)的存在，AuNPs的吸收峰紅移至670 nm左右．加入的適配體以范德華力、疏水作用及Au—N或Au—O鍵等形式吸附在AuNPs表面，通過(guò)靜電排斥有效阻止AuNPs的鹽誘導(dǎo)聚集，使溶液保持紅色[9]．加入SDM后，適配體與SDM特異性結(jié)合形成復(fù)雜的剛性結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)能影響AuNPs和適配體堿基之間的作用力，使得適配體從AuNPs表面脫落[12]．在高濃度NaCl條件下，失去適配體保護(hù)作用的AuNPs會(huì)再次聚集，溶液顏色由紅色轉(zhuǎn)為紫色至藍(lán)色，且520 nm處的吸光度降低(見(jiàn)圖1)．因此，基于AuNPs的聚集程度及相應(yīng)溶液的顏色變化，可實(shí)現(xiàn)SDM的可視化比色檢測(cè)；根據(jù)AuNPs在670 nm 和520 nm處吸光度比值(A670/A520)的變化，可實(shí)現(xiàn)SDM的定量檢測(cè)．

圖1 AuNPs在不同溶液中的紫外可見(jiàn)吸收光譜

2.2 不同溶液中AuNPs的表征

利用透射電子顯微鏡對(duì)AuNPs在不同溶液中的形貌及聚集狀態(tài)進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示．圖2A表明，分散良好的AuNPs呈光滑的球形，平均粒徑約為15 nm．據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道，粒徑為15 nm的AuNPs溶液在波長(zhǎng)為520 nm處的消光系數(shù)為2.7×108M-1·cm-1，根據(jù)朗伯—比爾定律可得出AuNPs溶液濃度為2.5 nmol/L．加入一定量的NaCl后，AuNPs發(fā)生聚集(見(jiàn)圖2B)．而加入適配體后，AuNPs能夠抵抗鹽誘導(dǎo)引起的聚集(見(jiàn)圖2C)．繼續(xù)加入SDM，會(huì)使吸附的適配體從AuNPs表面脫落，導(dǎo)致AuNPs聚集(見(jiàn)圖2D)．

A：AuNPs；B：AuNPs+NaCl；

為了進(jìn)一步研究溶液中AuNPs的聚集狀態(tài)及其與適配體的作用情況，對(duì)不同條件下AuNPs的Zeta電位進(jìn)行測(cè)定．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AuNPs溶液的Zeta電位為-18.9 mV．AuNPs與適配體混合5 min后，測(cè)得Zeta電位為-9.6 mV，表明適配體吸附在AuNPs表面．向上述溶液中再加入SDM，反應(yīng)5 min后，Zeta電位值為-16.8 mV，表明部分適配體從金納米粒子表面脫落．實(shí)驗(yàn)所得到的Zeta電位變化趨勢(shì)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[13]．

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化選擇

2.3.1 NaCl濃度對(duì)AuNPs聚集的影響

考察了不同濃度的NaCl溶液對(duì)適配體-納米金比色傳感體系吸光度的影響(見(jiàn)圖3)．從圖3A可以看出，未加入NaCl時(shí)，AuNPs溶液為紅色且分散良好的溶液，在520 nm處有較大的吸光度；隨著NaCl濃度的增加，體系顏色逐漸從紅色變?yōu)闇\紫色再變?yōu)樗{(lán)色，520 nm處的吸光度逐漸降低，670 nm處的吸光度逐漸增強(qiáng)．同時(shí)，AuNPs溶液在 670 nm 和520 nm 處的吸光度比值(A670/A520)逐漸增加(見(jiàn)圖3B)，這是由于鹽濃度的大小可以改變AuNPs表面所帶的負(fù)電荷，鹽濃度越高，AuNPs表面的負(fù)電荷越少，則越容易發(fā)生聚集[12]．當(dāng)加入的NaCl濃度高于66.7 mmol/L時(shí)，AuNPs表面的負(fù)電荷幾乎完全被中和，減小了AuNPs之間的靜電斥力，引起反應(yīng)體系中AuNPs的聚集．因此，為保證適配體-納米金比色傳感法中AuNPs完全聚集，NaCl的最優(yōu)濃度為66.7 mmol/L．

A：不同NaCl濃度下AuNPs溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜(從a至i濃度分別為：0，13.3，26.7，40.0，53.3，60.0，66.7，

2.3.2 適配體濃度對(duì)AuNPs聚集的影響

適配體濃度的大小會(huì)影響AuNPs的聚集程度，進(jìn)而影響到SDM檢測(cè)的靈敏度．因此，實(shí)驗(yàn)考察了不同濃度的適配體溶液(0.2～40.0 nmol/L)對(duì)AuNPs的聚集程度和吸光度的影響(見(jiàn)圖4)．如圖4A所示，當(dāng)適配體濃度為0.2 nmol/L時(shí)，AuNPs溶液呈藍(lán)色，說(shuō)明AuNPs主要呈現(xiàn)為聚集狀態(tài)，且在520 nm處的吸光度較弱．隨著適配體濃度的增加，AuNPs溶液的顏色逐漸從藍(lán)色變?yōu)闇\紫色再變?yōu)榧t色，且520 nm處的吸光度逐漸增強(qiáng)．此外，從圖4B可以看出，適配體濃度為0.2～20.0 nmol/L時(shí)，AuNPs溶液在670 nm 和520 nm 處的吸光度比值(A670/A520)隨適配體濃度的增加而逐漸降低，當(dāng)適配體濃度高于20.0 nmol/L時(shí)，該比值基本不變，說(shuō)明此時(shí)AuNPs可在溶液中保持良好的分散狀態(tài)．因此，為防止鹽誘導(dǎo)下AuNPs的聚集，適配體的最優(yōu)濃度為20.0 nmol/L．

A：不同適配體濃度下AuNPs溶液的紫外可見(jiàn)吸收光譜(從a至g濃度分別為：0.2，5.0，10.0，16.0，20.0，

2.3.3 適配體與AuNPs反應(yīng)時(shí)間對(duì)AuNPs聚集的影響

圖5顯示了AuNPs與適配體分別反應(yīng)5，10，15，20，25，30 min后，AuNPs溶液在670 nm 和520 nm處的吸光度比值(A670/A520)變化情況．從圖5可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，該吸光度比值(A670/A520)無(wú)明顯改變，說(shuō)明適配體與AuNPs之間的結(jié)合速度較快，適配體與納米金的結(jié)合基本達(dá)到飽和．因此，為了縮短分析時(shí)間，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中適配體和AuNPs的反應(yīng)時(shí)間設(shè)為5 min．

2.4 對(duì)適配體-納米金比色傳感法的評(píng)估

在最優(yōu)反應(yīng)條件(NaCl 66.7 mmol/L，適配體20.0 nmol/L，適配體和AuNPs反應(yīng)5 min)下，向適配體-AuNPs溶液中加入不同濃度的SDM，并記錄其紫外可見(jiàn)吸收光譜的變化．從圖6可以看出，隨著SDM濃度的增加，溶液顏色由紅色變?yōu)樽仙了{(lán)色，且AuNPs在670 nm 和520 nm處的吸光度比值(A670/A520)逐漸增大，內(nèi)插圖為相應(yīng)的溶液顏色變化．吸光度比值與SDM濃度在0.033～3.333 μmol/L時(shí)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系(見(jiàn)圖6)，線(xiàn)性方程為y=0.174 8x+0.254 9，相關(guān)系數(shù)為0.994 3，檢測(cè)限為0.003 μmol/L，靈敏度較高，可滿(mǎn)足實(shí)際樣品中SDM的檢測(cè)需求．

與文獻(xiàn)報(bào)道的SDM分析方法相比較(見(jiàn)表1)，本文所建立的方法分析時(shí)間縮短至15 min，優(yōu)于文獻(xiàn)中報(bào)道的分析方法．與已報(bào)道的高效液相色譜法[2,14]和毛細(xì)管電泳法[3]相比，比色傳感法操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高；而在基于適配體的熒光傳感法[10,15]中，適配體的共價(jià)標(biāo)記過(guò)程比較繁瑣、耗時(shí)(125 min)，且修飾的熒光基團(tuán)(和猝滅基團(tuán))會(huì)降低適配體的親和力和選擇性．因此，本文所建立的適配體比色傳感法無(wú)需繁瑣的修飾和標(biāo)記步驟，具有操作簡(jiǎn)單、分析時(shí)間短、靈敏度高、裸眼可視等優(yōu)點(diǎn)．

圖5 適配體與AuNPs的反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度比值的影響

圖6 SDM濃度與吸光度比值的線(xiàn)性關(guān)系曲線(xiàn)

方法檢測(cè)限/(μmol·L-1)線(xiàn)性范圍/(μmol·L-1)t/min參考文獻(xiàn)基于環(huán)糊精有機(jī)框架的HPLC法0.0050.032～3.22230[2]毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測(cè)法0.0580.967～64.44716[3]基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的熒光法0.0320.032～1.61195[10]基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的熒光法0.0060.032～0.161125[14]基于十二烷基苯磺酸鈉的HPLC法0.0020.003～0.64446[15]適配體-AuNPs比色傳感法0.0030.033～3.33315—

2.5 適配體-納米金比色傳感法對(duì)SDM的選擇性

在最優(yōu)反應(yīng)條件下，將其他抗生素(如OTC，CIP，LOM等)和金屬離子(如K+，Ca2+，Mg2+，F(xiàn)e3+等)分別加入到適配體-AuNPs溶液中，記錄其吸光度變化并計(jì)算A670/A520值，以考察所建立的適配體比色傳感方法對(duì)SDM的選擇性．從圖7可以看出，加入SDM后，AuNPs溶液在670 nm 和520 nm處的吸光度比值約為1.0，而加入抗生素或金屬離子后，該比值均小于0.1．這說(shuō)明在其他抗生素和金屬離子存在的情況下，所建立的分析方法對(duì)SDM有較好的選擇性．

圖7 適配體比色傳感法對(duì)SDM的選擇性

2.6 適配體-納米金比色傳感法對(duì)尿樣中SDM的檢測(cè)

為了評(píng)估所建立的適配體-AuNPs比色傳感方法的準(zhǔn)確性和適用性，以健康人體尿樣為樣品基質(zhì)，在最優(yōu)條件下，分別向適配體-納米金體系中加入3個(gè)濃度水平的SDM，并記錄其在670 nm 和520 nm處的吸光度比值變化情況．從表2可以看出，尿樣中SDM的回收率為99.3%～105.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于3.0%．結(jié)果表明，所建立的適配體比色傳感法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度性，可用于尿樣中SDM的快速檢測(cè)．

3 總 結(jié)

基于鹽誘導(dǎo)下AuNPs的聚集及適配體與目標(biāo)物SDM之間高選擇特異性結(jié)合的原理，建立了一種快速檢測(cè)SDM的適配體比色傳感法，并將其成功應(yīng)用于尿樣中SDM的分析檢測(cè)．本文所建立的適配體比色傳感法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、耗時(shí)短、選擇性好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于復(fù)雜樣品中SDM的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)．此外，該方法還為其他適配體探針定量分析小分子提供了新的思路．

表2 尿樣中SDM的分析結(jié)果(n=3)