蔡雯婷，孫 娟，董文華，劉曉言，董清華

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點實驗室/北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

隨著草莓Fragaria×ananassa果實的成熟, 果皮中花色素苷大量積累最終呈現(xiàn)紅色[1]?；ㄉ剀諏儆陬慄S酮化合物，廣泛存在于植物果實表皮細(xì)胞的液泡中[2]。查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase，CHI，EC 5.5.1.6)是花色素苷合成的關(guān)鍵酶和限速酶，該酶(CHI)和查爾酮合成酶(CHS)兩者一起協(xié)同調(diào)控花色素苷合成，CHI參與查爾酮的異構(gòu)化并催化查爾酮(Chalcone)生成柚皮素(Naringenin)，經(jīng)過其他酶的催化最終形成花色素苷[3,4,5]。CHI基因作為花色素苷合成的結(jié)構(gòu)基因[6]，其表達(dá)量的高低直接影響植物花色或果實著色，因此CHI基因調(diào)控機(jī)制的研究對于了解草莓花色素苷形成的分子機(jī)理有著重要意義。

查爾酮異構(gòu)酶是最先從大豆中發(fā)現(xiàn)[7]，1987 年從法國菜豆(Phaseolusvulgaris)中克隆獲得CHI基因[8]，目前該基因已在煙草[9]、矮牽牛[10]、番茄[11]、芍藥[12]、黃花蒿[13]、蘋果[14]等多種植物中被克隆。在紅果、黃果兩種森林草莓(Fragariavesca)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，與紅果草莓相比，F(xiàn)vCHI基因表達(dá)量在黃果草莓中下調(diào)，該基因表達(dá)量與花色素苷的積累呈正相關(guān)[15]。‘紅顏’草莓屬于光敏感型草莓，果實中FaCHI基因隨著透光率的降低而表達(dá)量下降，說明‘紅顏’草莓果實著色與FaCHI密切相關(guān)[16]。

目前草莓中CHI基因多在轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量的差異與花色素苷合成有關(guān)，但未見報道有關(guān)八倍體草莓的FaCHI基因克隆與表達(dá)等研究。本研究利用前期不同顏色的‘紅顏’草莓果實轉(zhuǎn)錄組篩選出在著色期表達(dá)量顯著的差異基因，即FaCHI，本試驗從‘紅顏’草莓中克隆FaCHI基因，通過生物信息學(xué)分析和在草莓著色過程中的實時熒光定量分析，初步探明查爾酮異構(gòu)酶基因在草莓花色素苷合成過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：以種植于北京市大興區(qū)長子營鎮(zhèn)和莓莊園的八倍體‘紅顏’草莓果實為研究材料，采集花后14 d大綠果，花后19 d大白果、花后25 d轉(zhuǎn)色果、花后28 d全紅果，將果實去籽后液氮速凍，保存-80 ℃冰箱備用，用于RNA提取。

試劑盒：植物RNA提取試劑盒(OMEGA，China)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金，北京)、Q5 High-Fidelity DNA Polymerase(博邁德生物，北京)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Axygen，China)、T1-simple載體(全式金，北京)、大腸桿菌Trans1-T1克隆感受態(tài)細(xì)胞(全式金，北京)、2×Taq PCR MasterMix(博邁德生物)、質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen，China)、TransStart Top Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒(全式金，北京)。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA 草莓果實(大綠期，白果期、轉(zhuǎn)色期、全紅期)總RNA提取參照OMEGA植物RNA提取試劑盒方法，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(全式金公司，北京)將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 克隆FaCHI基因 根據(jù)前期草莓轉(zhuǎn)錄組提供的基因序列與NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對得到編碼序列信息，獲得完整的FaCHI基因序列(Genbank Number:AB201754.1)。設(shè)計引物Forward primer：5’-ATGGCTCAATCAGTCACCGGAA-3’；Reverse primer：5’-TCATGCCTTGTTTTCTGCTTCCTT-3’。PCR擴(kuò)增體系參考Q5 High-Fidelity DNA Polymerase說明書，反應(yīng)條件98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min；循環(huán)數(shù)35；72 ℃延伸2 min。將PCR產(chǎn)物電泳檢測目的條帶，將正確位置的目的片段使用Axygen瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒提取目的基因，回收目的基因的產(chǎn)物連接T1-simple載體，轉(zhuǎn)入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性單菌落用2×Taq PCR Master Mix酶PCR檢測，挑選正確位置的條帶的菌落培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序(上海生工生物工程有限公司北京測序部)，測序成功樣品于-80 ℃保菌待用。

1.2.3FaCHI基因生物信息學(xué)分析 利用BLAST 對克隆的目的序列進(jìn)行同源比對，分析其功能保守結(jié)構(gòu)域；使用DNAMAN對該基因進(jìn)行氨基酸序列的分析；篩選適宜物種后通過MEGA5.1構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.4FaCHI基因?qū)崟r熒光定量分析 提取‘紅顏’草莓果實的4個時期的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。設(shè)計熒光定量引物FaCHI-Forward primer：5’-AAAGATCAGACCTTCCCACC-3’；FaCHI-Reverse primer：5’-AATCACCGCATTCCCAAC-3’，以草莓FaAPI作為內(nèi)參基因，F(xiàn)aAPI-Forward primer：5’-GGCCCAACGACAATTATTACTG-3’；FaAPI-Reverse primer：5’-AACCACAGTCTTGCATTCTTGACT-3’。參考TransStart Top Green qPCR SuperMix熒光定量試劑盒說明書，使用10 μL體系于實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche Light Cycler 96)檢測該基因表達(dá)水平。擴(kuò)增程序：94 ℃，10 min；94 ℃，30 s；56 ℃，20 s；72 ℃，20 s；循環(huán)數(shù)40。數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCT法分析基因表達(dá)量，每個樣品3個生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 FaCHI基因的克隆和分析

以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到清晰的條帶(圖1)。目的片段回收純化，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化、測序拼接等過程，得到FaCHI基因開放閱讀框714 bp，編碼氨基酸237個(圖2)。使用DNAMAN與八倍體草莓基因編碼的氨基酸序列(Genbank Number: Q4AE12.1)比對，相似度97.90%；氨基酸相似度97.89%。

2.2 草莓FaCHI基因的生物學(xué)分析

使用Expasy-ProtParam在線分析顯示，蛋白相對分子量為25.4 kD，理論等電點(pI)為5.31，脂肪族氨基指數(shù)為80.63，親水平均系數(shù)為(GRAVY): -0.118。通過NCBI Conserved Domain Search對FaCHI進(jìn)行功能域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)查爾酮合酶(chalcone synthase, CHS)超家族保守序列(圖3)，該家族編碼多種重要的酶，可以催化和合成植物次生代謝產(chǎn)物，具有不同的結(jié)構(gòu)和生物活性[17]。

進(jìn)化樹分析表明(圖4)，F(xiàn)aCHI基因在進(jìn)化上具有明顯種屬特性，F(xiàn)aCHI氨基酸序列與同為草莓屬的八倍體草莓(Fragaria×ananassa，Q4AE12.1)

圖1 FaCHI基因擴(kuò)增Fig.1 The PCR product in FaCHI gene

圖2 FaCHI 基因的核苷酸序列及氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and amino acid sequence of FaCHI gene

圖3 FaCHI保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domains of FaCHI

和二倍體草莓(Fragariavescasubsp.Vesca，XP_004307451.1)親緣關(guān)系最近；與薔薇屬的玫瑰(Rosarugosa，AKT71851.1)、月季(Rosachinensis，XP_024176829.1)、薔薇(Rosahybridcultivar，AYU56554.1)的親緣關(guān)系較近，以上草莓屬與薔薇屬聚為一個分支；與同為薔薇科李屬的吉野櫻(Prunusyedoensisvar.nudiflora，PQQ16500.1)、歐洲酸櫻桃(Prunuscerasus，AJO67976.1)、桃(Prunuspersica， XP_007218371.1)、紫葉李(Prunuscerasifera，AKV89240.1)、歐洲甜櫻桃(Prunusavium，XP_021813821.1)、梅(Prunusmume，XP_008233532.1)聚為另一個分支，親緣關(guān)系次之。

圖4 FaCHI系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of FaCHI

2.3 FaCHI基因在草莓著色過程中的表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)對FaCHI基因在草莓果實大綠、白果、轉(zhuǎn)色、全紅4個時期的相對表達(dá)量進(jìn)行測定(圖5)。結(jié)果顯示，F(xiàn)aCHI基因在草莓大綠時期(花后14 d)到白果時期(花后19 d)表達(dá)量下調(diào)，隨著果實顏色的加深表達(dá)量逐漸升高，全紅時期(花后28 d)表達(dá)量最高。

圖5 ‘紅顏’草莓果實大綠、白果、轉(zhuǎn)色、全紅4個時期中FaCHI相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression level of FaCHI in four stages of 'Benihoppe' strawberry fruits: big green, white, partially red and full red

3 討 論

前人的研究證實了查爾酮異構(gòu)酶是花色素苷合成途徑早期的關(guān)鍵酶之一，其表達(dá)的效率直接影響到植物花和果實的色澤和質(zhì)量[18]。在森林草莓轉(zhuǎn)錄組的分析和‘紅顏’草莓遮光處理中發(fā)現(xiàn)查爾酮異構(gòu)酶基因調(diào)控草莓花色素苷的合成，同時印證了在草莓中該基因與花色素苷的積累呈正相關(guān)這一結(jié)論[15,16]。最新研究表明，對不同品種栽培草莓的3個果實發(fā)育階段進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，高花色素苷品種中FaCHI基因表達(dá)量要高于低花色素苷品種，并且該基因表達(dá)趨勢都是隨著果實的成熟，表達(dá)量趨勢上升[19]。這一重要作用揭示了FaCHI基因是控制草莓果實花色素苷合成的關(guān)鍵酶。研究查爾酮異構(gòu)酶基因，有利于從分子層面調(diào)控草莓花色素苷等類黃酮化合物的形成。

本研究成功克隆出八倍體草莓FaCHI的全長基因，開放閱讀框的大小為714 bp，編碼237個氨基酸。通過與NCBI上所刊載的其他植物的氨基酸序列進(jìn)行相似性比對，發(fā)現(xiàn)CHI基因具有較高的同源性，根據(jù)結(jié)果生成的進(jìn)化樹可以清楚的發(fā)現(xiàn)八倍體‘紅顏’草莓CHI 蛋白序列和薔薇科的草莓屬與薔薇屬植物的CHI蛋白序列相似度比較高且聚為一類，而梅、吉野櫻、桃和甜櫻桃等李屬果樹相似度聚為一類，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因有兩方面，一是CHI蛋白在不同植物間的同源性一般為42%～65%[20]，同一類型植物的CHI的氨基酸同源性可達(dá)70%以上[21]；二是月季、玫瑰等薔薇屬植物屬于園林景觀植物，在馴化方向上更關(guān)注于花色差異，而歐洲甜櫻桃、桃等薔薇科李屬植物屬于經(jīng)濟(jì)林，其馴化方向大多是針對果實的大小，含糖量多少等方面，對花色方面研究不多[22]。

通過對草莓果實4個時期的實時熒光定量分析，F(xiàn)aCHI基因在果實的全紅期表達(dá)量最高，證實了查爾酮異構(gòu)酶基因在草莓花色素苷合成過程中起重要作用。本試驗中FaCHI基因在大綠期到白果期表達(dá)量降低，這一時期草莓果實膨大，果實顏色由綠變白，說明該基因在大綠時期基因啟動表達(dá)，積累黃烷酮底物(Flavanone)，而白果期表達(dá)量降低，推斷積累的反應(yīng)底物黃烷酮發(fā)生反饋抑制使該酶活性降低[23]，轉(zhuǎn)色期作為果實著色期，此時FaCHI基因表達(dá)量開始升高，到全紅時期果實成熟期表達(dá)量最高,說明FaCHI基因在果實發(fā)育階段后期即草莓著色時期的表達(dá)量相對較高，因而在成熟果實中產(chǎn)生了花色素苷的積累[24]。與蘋果中CHI基因在未成熟果實的酶活性較高，在中間期下降，成熟后上升，成熟果實的酶活性不同于未成熟果實中高的結(jié)論一致[14]。

本試驗成功分離了八倍體草莓的FaCHI基因，并對該基因在草莓發(fā)育過程中的表達(dá)特性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其在草莓花色素苷合成途徑的調(diào)控和表達(dá)機(jī)制的研究提供依據(jù)，但該基因在草莓花色素苷合成上的作用機(jī)制還需進(jìn)一步借助于基因敲除技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的驗證。