程 昊，張亞楠，張 潔，顧子正，曾天賦美，張 杰

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物生產(chǎn)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心/ 北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

觀賞海棠紅葉品種‘王族’具有紫葉紫花紫果的特征，屬于北美海棠[1]，適應(yīng)性強(qiáng)且樹形優(yōu)美，常被作為園林觀賞樹木。其顏色的形成主要?dú)w因于花色素苷的積累，花色素苷[2]屬酚類化合物中的類黃酮類物質(zhì)，是構(gòu)成花瓣、葉片等顏色的主要水溶性色素。

與花色素苷生物合成相關(guān)的基因主要有兩種，一種是不同植物共同具有的結(jié)構(gòu)基因，編碼花色素苷生物合成酶；還有一種是調(diào)節(jié)基因，編碼產(chǎn)生的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)基因或花色素苷生物合成酶，從而影響花色素苷生物合成基因的表達(dá)[3]。因此，花色素苷的生物合成除了受其相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的影響，還會(huì)被調(diào)節(jié)基因影響[4-5]。另外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)激素也能間接影響花色素苷的生物合成，例如Gen Li[6]于2019年研究積累的ABA能夠刺激MYB-bHLH-WD40轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的轉(zhuǎn)錄，從而上調(diào)類黃酮生物合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，促進(jìn)花色素苷的產(chǎn)生使果實(shí)著色；Jorge Gonza’lez-Villagra[7]于2017年研究發(fā)現(xiàn)干旱條件下ABA可能增加miRNA156轉(zhuǎn)錄水平，調(diào)控花色素苷相關(guān)路徑基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)花色素苷的生物合成。

脫落酸(abscisic acid, ABA)普遍存在于植物的葉、休眠芽和成熟的種子中，能抑制植物細(xì)胞的分裂和種子萌發(fā)，可以提高植物的抗性。已有文獻(xiàn)報(bào)道在其他物種中ABA能夠影響花色素苷的含量，例如：在甜櫻桃[8]中，用外源ABA處理會(huì)影響PacMYBA的表達(dá)，促進(jìn)花色素苷的生物合成；在無花果[9]中，利用外源ABA和乙烯利處理能夠上調(diào)花色素苷含量，改善無花果果實(shí)的顏色。亦有文獻(xiàn)指出ABA處理可以改變蘋果果實(shí)內(nèi)源激素的變化，進(jìn)而導(dǎo)致蘋果果實(shí)著色的積累和其他一些重要品質(zhì)增加[10]。

HVA22[11-12]是一種獨(dú)特的受脫落酸誘導(dǎo)的基因，最早是在大麥糊粉細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。它幫助調(diào)節(jié)脅迫細(xì)胞的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，降低脅迫細(xì)胞的非必需分泌，從而達(dá)到提高植物抗性的作用。因此，通過施加外源ABA處理海棠組培苗，對于花色素苷含量進(jìn)行測定，研究外源ABA對于觀賞海棠的著色機(jī)理，并對觀賞海棠的McHVA22進(jìn)行克隆，將其瞬時(shí)轉(zhuǎn)入組培苗‘王族’中，對于花色素苷路徑相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量PCR分析，探究觀賞海棠中McHVA22對于花色素苷代謝途徑的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

觀賞海棠‘王族’葉片于2019年5月到北京市順義區(qū)木林鎮(zhèn)蔣各莊村有機(jī)觀光蘋果園中采集，采后分裝用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，迅速放入液氮中，置于冰箱-80 ℃保存。

瞬時(shí)侵染材料為北京農(nóng)學(xué)院組培中心保存的‘王族’海棠組培苗。培養(yǎng)條件：MS培養(yǎng)基(蔗糖30 g/L、瓊脂6 g/L、NAA 0.5 mg/L、6-BA 1 mg/L、pH 5.8～6.0)。培養(yǎng)溫度 23 ℃±2 ℃，相對濕度 60%～70%，光照強(qiáng)度 1 800～2 000 lx，光照設(shè)置 16 h光照/ 8 h黑暗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物總RNA的提取和cDNA的反轉(zhuǎn)錄 植物材料提取總RNA用艾德萊EASYspin Plus 多糖/多酚/復(fù)雜植物RNA快速提取試劑盒 (貨號(hào)RN5301) ，提取‘王族’葉片中的總RNA，測其濃度并進(jìn)行電泳檢測提取質(zhì)量，使用全式金兩步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2McHVA22克隆及其過表達(dá)載體的構(gòu)建 因?yàn)樘O果和海棠高度同源，使用NCBI找到蘋果的MdHVA22的相關(guān)基因信息，得到該基因在10號(hào)染色體上的NC_041802.1位置，找到相對應(yīng)的mRNA序列號(hào)XM_029092122.1，下載CDS區(qū)序列。通過Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物，正向引物MdHVA22-F: 5’-ATGTTGGGAAGCTTGCTTACCAGAATT-3’；反向引物MdHVA22-R: 5’- TCAGACATGGCGCCGGTTGACTGTG -3’。 以‘王族’葉片反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL、 2×EasyPfu PCR SuperMix 25 μL、MdHVA22-F 1 μL、MdHVA22-R 1 μL、H2O 21 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；利用95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 20 s，循環(huán)35次；然后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。將PCR克隆產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒 (艾德萊：DR0102) 進(jìn)行膠回收，膠回收的產(chǎn)物連接在pEasy-Blunt載體上，轉(zhuǎn)化大腸感受態(tài)Trans T1后挑選陽性克隆送公司測序。

將測序正確的質(zhì)粒與過表達(dá)載體pCAMBIA1300-EGFP用限制性內(nèi)切酶QuickCut Xba I (Takara：1634) 和QuickCut Kpn I (Takara：1618) 進(jìn)行雙酶切，得到的DNA片段和質(zhì)粒片段，將目的基因、載體質(zhì)粒與T4 DNA連接酶輕柔混勻后進(jìn)行金屬浴4 ℃連接過夜。

1.2.3McHVA22過表達(dá)載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化 采用農(nóng)桿菌凍融法將5 μL質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入50 μL農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中，涂板培養(yǎng)并挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，將正確的菌液繼續(xù)培養(yǎng)，收集菌液加入侵染液 (10 mmol/L MES、10 mmol/L MgCl2、200 μmol/L AS、無菌水) 調(diào)節(jié)菌液OD值到0.8～0.9。取生長良好且大小相似的‘王族’組培苗，使用真空抽吸的方法將菌液轉(zhuǎn)入組培苗中，用濾紙吸干表面的菌液后接種于培養(yǎng)基 (MS培養(yǎng)基添加300 mg/L頭孢和50 mg/L卡那霉素) 中，組培室中培養(yǎng)10 d左右觀察表型。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR qRT-PCR的酶選擇大連寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司TB Green? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) (RR420A) ，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩步法，94 ℃進(jìn)行預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性20 s，用60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)38次。所有用到的熒光引物見表1，待測樣品數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次生物重復(fù)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.5 花色素苷含量測定 利用可見分光光度計(jì)的方法測定花色素苷含量，將待測材料在液氮中研磨成細(xì)粉，稱取樣品0.1 g，用植物花色素苷含量檢測試劑盒(索萊寶：BC1380)提取花色素苷，加入提取試劑充分混勻后分別測定在530 nm和700 nm處的吸光值，用計(jì)算公式計(jì)算得到花色素苷含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 ABA處理‘王族’海棠組培苗

分別用0.025 mg/L、0.05 mg/L、1 mg/L的ABA質(zhì)量對于觀賞海棠 ‘王族’組培苗進(jìn)行處理，可以觀察到圖1中隨著ABA濃度的增加，‘王族’組培苗的顏色也在增加。不同濃度ABA處理的組培苗進(jìn)行花色素苷含量的測定結(jié)果圖2可以看到。隨著ABA濃度的遞增，花色素苷的含量也在遞增。由此可知，花色素苷含量可隨ABA處理的濃度增加而增加。

2.2 McHVA22過表達(dá)載體的構(gòu)建以及瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化

以觀賞海棠‘王族’葉片作為克隆模板cDNA，PCR擴(kuò)增得到630 bp的McHVA22片段，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶正確的切膠后進(jìn)行膠回收，得到的產(chǎn)物重新進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，二次檢測成功的連接普通克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸后送公司測序。序列比對正確的連接過表達(dá)載體pCAMBIA1300-EGFP，用限制性內(nèi)切酶QuickCut Xba I和QuickCut Kpn I進(jìn)行雙酶切，并連接轉(zhuǎn)化，送公司測序，序列比對后將McHVA22過表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法瞬時(shí)轉(zhuǎn)化入‘王族’組培苗中，培養(yǎng)10 d左右觀察表型。

由圖3中與對照植物相比，可以觀察到瞬時(shí)轉(zhuǎn)化McHVA22過表達(dá)載體的組培苗明顯變紅。對于花色素苷路徑主要基因(PAL、CHS、CHI、UFGT)進(jìn)行熒光定量PCR檢測后，發(fā)現(xiàn)與對照相比，花色素苷相關(guān)路徑基因呈現(xiàn)顯著增加的趨勢。其次，對于影響花色素苷合成的轉(zhuǎn)錄因子(MYB4、MYB10)進(jìn)行熒光定量PCR檢測后，結(jié)果如圖4所示，與對照相比，調(diào)控花色素苷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子也呈現(xiàn)顯著增加的趨勢。與此同時(shí)，測定了瞬時(shí)轉(zhuǎn)化McHVA22過表達(dá)載體的組培苗的花色素苷的含量后發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化McHVA22過表達(dá)載體的組培苗的花色素苷含量顯著高于對照轉(zhuǎn)化的組培苗。因此，可得到McHVA22能夠正調(diào)控花色素苷路徑基因，進(jìn)而調(diào)節(jié)花色素苷的積累，促使葉片顏色變紅。

3 討 論

觀賞海棠種類繁多，花色豐富絢麗，其葉片、果實(shí)顏色近年來研究甚多[13-14]，而花色素苷是影響其顏色的重要物質(zhì)。在大部分被子植物的不同器官當(dāng)中都能檢測到花色素苷的存在，包括果實(shí)、花朵、莖和葉，花色素苷是構(gòu)成花瓣、果實(shí)等顏色的主要水溶性色素。此外，花色素苷在抗癌、抗炎、抗自由基、降血糖等方面均有重要作用[15]。但是花色素苷的生物合成易受各種因素的影響，如光照、水分、激素、礦物質(zhì)元素等，因此對于花色素苷的研究就顯得極為重要。

ABA作為激素對于花色素苷的調(diào)控起到了不可忽視的作用，果實(shí)著色是果實(shí)成熟的一個(gè)重要標(biāo)志，在這個(gè)過程中ABA起到了重要的作用。在荔枝[16]中，內(nèi)源ABA含量在葉綠素降解時(shí)急劇增加，ABA水平在花色素苷開始積累之前達(dá)到峰值，表明ABA在荔枝果實(shí)著色過程中起著重要作用。在其他果實(shí)，如蘋果、甜櫻桃、無花果等皆有報(bào)道。

在植物中，HVA22在不同的組織中普遍表達(dá)，例如種子，芽和根，并且會(huì)受ABA介導(dǎo)的幾種環(huán)境脅迫條件(例如寒冷和干旱)誘導(dǎo)。最近的研究中，ABA處理能夠改變內(nèi)源激素的平衡，從而調(diào)控蘋果果實(shí)著色的積累，而HVA22能夠受ABA誘導(dǎo)產(chǎn)生，因此推測HVA22是否與花色素苷的調(diào)控產(chǎn)生聯(lián)系。通過研究發(fā)現(xiàn)，ABA能夠誘導(dǎo)觀賞海棠葉片花色素苷的積累，且McHVA22能夠正調(diào)控觀賞海棠葉片中花色素苷路徑基因的相對表達(dá)水平，從而增加花色素苷的積累。因此，本研究為HVA22對于花色素苷的調(diào)控提供了一定的理論基礎(chǔ)。