研究意義：辣椒疫病是由辣椒疫霉引起的具有毀滅性的土傳病害，自該病被發(fā)現(xiàn)以來，在辣椒產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，除危害辣椒外，辣椒疫霉也可侵染番茄、茄子、黃瓜、西瓜、南瓜等多種作物，其發(fā)病速度快，傳播范圍廣，是影響辣椒生產(chǎn)的最主要病害。辣椒是一種重要的蔬菜作物，在全世界都有普遍栽培，中國是辣椒生產(chǎn)大國。辣椒疫病的發(fā)生，不僅對(duì)辣椒產(chǎn)量造成重大損失，而且嚴(yán)重影響了辣椒的品質(zhì)。目前防治辣椒病害最有效的手段是化學(xué)方法，然而化學(xué)方法防治病害副作用明顯，帶來農(nóng)藥殘留超標(biāo)、生態(tài)環(huán)境遭受破壞等一系列問題。因此，通過生物防治的方法來控制植物病害的發(fā)生，對(duì)綠色無污染農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展日益重要。國內(nèi)外許多研究證實(shí)，采用對(duì)辣椒疫霉具有拮抗作用的微生物防控辣椒疫病是一種環(huán)境友好型的有效方法，已取得較好的進(jìn)展；其中，芽孢桿菌和木霉菌繁殖速度快、生命力強(qiáng)，并能產(chǎn)生有機(jī)酸、酶以及抗菌肽等豐富的代謝物，對(duì)植株具有促生作用，對(duì)病原菌具有寄生作用，被研究和應(yīng)用較多。本研究切入點(diǎn)：目前對(duì)于生物防治的研究，主要集中在實(shí)驗(yàn)室階段，有關(guān)室外的大面積應(yīng)用相對(duì)較少，本研究以生防菌株和植物營養(yǎng)與生物肥料相結(jié)合的目的，開展相關(guān)研發(fā)工作。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試病原菌辣椒疫霉菌由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院保存。

1.1.2 培養(yǎng)基改良PDA瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。

1.1.3 供試?yán)苯菲贩N湘研5號(hào)辣椒。

1.2 拮抗細(xì)菌的分離

1.2.1 土壤樣品的采集從湖南瀏陽、永州、郴州、湘西自治州等地采集健康辣椒植株及其根部土壤。土樣采集方法，去除表層土壤，采取5~10 cm處的土樣約200 g，揀出碎石，木屑等雜質(zhì)，分裝標(biāo)記帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 樣品分離利用稀釋平板分離法，稱取處理后的土樣10 g，放入裝有玻璃珠和90 mL無菌水的三角瓶中，震蕩30 min。將混合均勻的液體，逐級(jí)以10倍稀釋，分別吸取10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液100 μL加到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至35℃的溫箱中，倒置培養(yǎng)1～2 d。

1.3 拮抗細(xì)菌的篩選

將活化的辣椒疫霉菌接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用直徑7 mm打孔器打取生長良好菌餅，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基的平板中央。以平板對(duì)峙的方法，將純化后的細(xì)菌點(diǎn)接到辣椒疫霉菌餅四周對(duì)稱位置，30℃下培養(yǎng)7 d后，待對(duì)照皿中辣椒疫霉菌絲鋪滿培養(yǎng)皿時(shí)，測量菌落直徑，計(jì)算抑制率，抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑)×100。

1.4 拮抗細(xì)菌HNND-5的鑒定

1.4.1 拮抗菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特征觀察及生理生化試驗(yàn)

1.4.2 16S rDNA 測序及序列分析

采用試劑盒提取菌株H N N D-5的總D N A，試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，以PCR 擴(kuò)增，正向引物5’-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3’ 反向引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ PCR反應(yīng)體系（20μL）：10×Buffer 2μL，Taq 酶0.4μL，dNTP 2 μL，引物各1μL，以ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 5 min；95℃ 45 s，50℃ 30 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物切膠回收測序，測序工作由華大基因完成，測序結(jié)果通過GenBank進(jìn)行Blast序列同源性比對(duì)。

1.5 盆栽試驗(yàn)

1.5.1 辣椒疫霉菌懸浮液制備 將在PDA培養(yǎng)皿活化的辣椒疫霉病菌菌絲塊接種于裝有200 mL PDB培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，每瓶接種3塊，28℃，160 r/min培養(yǎng)5~7 d，然后將辣椒疫霉菌培養(yǎng)液倒入組織搗碎機(jī)中，制成菌絲懸浮液備用。

1.5.2 拮抗菌發(fā)酵液制備將篩選出的細(xì)菌（HNND-5、NTGB-113、NTGB-114、NTGB-116）接種到NB（蛋白胨 10 gL-1，牛肉浸出粉5 gL-1，NaCl 5 gL-1）中，于30℃，160 r/min培養(yǎng)1 d待用，測定各菌株發(fā)酵有效活菌數(shù)，然后將發(fā)酵置于4℃條件下保存待用。

1.5.3 試驗(yàn)方法

（1）試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)5個(gè)處理，分別為NB培養(yǎng)基（CK）、HNND-5發(fā)酵液、NTGB-113發(fā)酵液、NTGB-114發(fā)酵液、NTGB-116發(fā)酵液。4組拮抗菌發(fā)酵液用無菌水稀釋至1×106cfu/mL，辣椒疫霉病病菌懸浮液用無菌水稀釋至1×108cfu/mL。九孔營養(yǎng)缽中每孔缽2粒辣椒種子，待辣椒長至3~4片葉時(shí)，于每株辣椒苗根際施用5 mL相對(duì)應(yīng)拮抗菌發(fā)酵液和NB培養(yǎng)基，然后每個(gè)處理施加辣椒疫霉病病菌懸浮液5 mL。

發(fā)病率（%）=（發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)）×100%；

防治效果（%）=[1-處理組發(fā)病株率/對(duì)照發(fā)病株率]×100%。

定義兩個(gè)坐標(biāo)系，慣性坐標(biāo)系OXYZ，質(zhì)心O為地球中心，以赤道平面為基準(zhǔn)，Z軸垂直于平面，Y軸進(jìn)行右手系方向；小行星軌道坐標(biāo)系LVLH（oxyz），質(zhì)心在小行星的中心，軌道平面為基準(zhǔn)，z軸垂直于平面，y軸進(jìn)行右手系方向，如圖2所示：

（2）測定方法測量從辣椒基部至主莖頂部之間的距離為株高。將辣椒植株從近根結(jié)的第一個(gè)節(jié)點(diǎn)剪斷，分別稱取上半部分和根系部分質(zhì)量，標(biāo)記為鮮質(zhì)量，放于105℃殺青10 min，然后放于85℃烘箱中，烘至恒重，分別稱量，標(biāo)記為干質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株對(duì)辣椒疫霉菌的抑制效果

從辣椒植株根際土壤中篩選出4株對(duì)辣椒疫霉有拮抗作用的細(xì)菌。從表1可以看出，通過平板對(duì)峙試驗(yàn)，測得4株拮抗菌抑制率為65.34%~67.00%。其中以HNND-5細(xì)菌的抑菌效果最好，為67.00%，明顯高于其他菌株。抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明：通過分離篩選辣椒根際土壤中的微生物，可以獲得許多對(duì)辣椒疫霉具有抑制作用的拮抗菌。

表1 拮抗菌對(duì)辣椒疫霉菌的抑制測定結(jié)果

2.2 菌株HNND-5的鑒定

2.2.1 菌株HNND-5形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征在NA固體培養(yǎng)基上，菌株HNND-5菌落成圓形、乳白色，邊緣不規(guī)則，凸起，表面濕潤，革蘭氏染色為陽性，細(xì)胞呈長桿狀，有芽孢。結(jié)合拮抗菌株HNND-5生理生化特征（見表2）和形態(tài)特征，初步判定HNND-5菌株屬于芽孢桿菌屬。

項(xiàng)目 反應(yīng) 項(xiàng)目 反應(yīng)革蘭氏反應(yīng) + 5%NaCl +苯丙氨酸脫氫酶 + 10%NaCl +V-P測定 + 接觸酶 +葡萄糖產(chǎn)酸 + 明膠水解 +蔗糖產(chǎn)酸 + 淀粉水解 +

葡萄糖產(chǎn)氣 - 纖維素水解 +蔗糖產(chǎn)氣 - 檸檬酸鹽利用 +吲哚反應(yīng) - 硝酸鹽還原 +

2.2.2 16SrDNA序列分析與系統(tǒng)進(jìn)化樹利用PCR回收產(chǎn)物直接測序，通過DNAMAN軟件拼接后得到菌株HNND-5的16SrDNA部分有效序列，序列長度為1 347bp，NCBI登錄號(hào)為KY441416，將該序列與GenBank中己知序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示：菌株HNND-5 與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（登錄號(hào)：JQ765434.1）的序列相似性為100%。采用鄰接法構(gòu)建菌株HNND-516S基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株HNND-5與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌處于同一分支，親緣關(guān)系最近且遺傳距離一致。

2.2 不同菌株對(duì)辣椒生長的影響

通過施用拮抗菌發(fā)酵液，辣椒株高增長，上半部分鮮、干質(zhì)量及根系鮮、干質(zhì)量均高于CK。在株高方面，與CK相比較，其他4個(gè)處理都有明顯優(yōu)勢，其中HNND-5提高12.00%，NTGB-113提高20.68%，NTGB-114提高14.19%，NTGB-116提高13.41%。上部干鮮比重，五個(gè)處理差異不明顯，HNND-5和NTGB-113為0.94，NTGB-114和NTGB-116為0.91，CK為0.91。根系干鮮比重，HNND-5和NTGB-113明顯優(yōu)于CK，相比CK而言，分別增加16.90%和18.31%。

2.3 不同處理對(duì)辣椒疫病發(fā)生情況的影響

通過不同處理，辣椒疫病發(fā)病情況差異明顯。試驗(yàn)結(jié)果顯示：4株拮抗菌的防治效果為57.94%~73.02%，其中以HNND-5細(xì)菌的防治效果最好，為73.02%，明顯高于其他菌株。防治效果試驗(yàn)結(jié)果表明：拮抗菌發(fā)酵液可有效地降低辣椒疫病的發(fā)病情況，具有良好的防病能力。

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，從辣椒根際篩選的HNND-5菌株對(duì)辣椒疫霉的抑制作用顯著，其平板對(duì)峙試驗(yàn)的抑制率為67.00%，且對(duì)黃瓜枯萎病菌、馬鈴薯立枯病菌等土傳性病原菌有明顯的抑制作用。通過試驗(yàn)可知HNND-5菌株發(fā)酵液對(duì)辣椒的生長、鮮重、干重具有明顯的促生作用。與對(duì)照相比較，HNND-5菌株發(fā)酵液可使辣椒株高增加12.00%，根系干鮮比重增加16.90%，上部干鮮比重增長不明顯。在防治效果方面，HNND-5菌株發(fā)酵液的防效達(dá)到73.02%；NTGB-113、NTGB-114、NTGB-116等也有明顯的防治效果。

芽孢桿菌是生物防治中應(yīng)用最多的一類微生物，在水稻根系土壤中首次分離得到甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌并開展大量研究工作，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)辣椒黑脛病菌、香蕉枯萎病菌、黃瓜炭疽病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄青枯菌、番茄灰霉病菌、立枯絲核菌及水稻稻瘟病菌具有較強(qiáng)的抑制活性。本研究篩選出的HNND-5菌株具有明顯抑制辣椒疫霉病菌的作用，且抑菌譜較廣，這與他人的研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

從土壤中篩選的拮抗菌株對(duì)植物病原菌的生長有明顯的抑制作用；拮抗菌發(fā)酵液對(duì)植物的生長有明顯的促進(jìn)作用，在較大程度上提高植物的干物質(zhì)量；施用拮抗菌發(fā)酵液后，植物抵抗植物病原菌侵染的能力顯著提高，發(fā)病率明顯降低。