摘 要：青錢柳代用茶黃酮單體成份檢測過程中“樣品回流后冷卻稱重，加入純甲醇至回流前重量”步驟，在實際操作過程中要求做到“衡重”存在一定弊端、難度和安全風(fēng)險。本文減少“衡重”實驗步驟引入校正系數(shù)F參與計算（簡稱方法2），通過分析純甲醇的毒性、減少不確定度因素提高不確定度及減少實驗過程工作量等考慮因素提出方法2的必要性;通過對Fv與Fm計算及驗證，2例實例計算Fv與Fm相對誤差值0.17%和0.45%，均遠遠小于5%，得出方法2檢驗的可行性和一致性;通過分析比較2種方法6種檢測目標物的RSD值（n=5）1.35%～4.48%，均小于5%，得出2種檢驗方法結(jié)果的一致性。

關(guān)鍵詞：青錢柳代用茶檢測;校正系數(shù)F;應(yīng)用

基金項目：湖南省食品藥品監(jiān)督管理局“湘西州人工種植青錢柳的質(zhì)量安全性評價及青錢柳葉代用茶質(zhì)量標準研究”（項目編號：湘食藥科R201726）? 青錢柳為胡桃科青錢柳屬植物，我國獨有單種屬植物，屬國家二級保護樹種，別名金錢柳、銅錢樹、搖錢樹等。主要生長在中國南部海拔 420～2500m 的高山野外，現(xiàn)也有部分人工種植林，較多見于湖南、江西等省份，湖南省境內(nèi)主要分布在湘西州和邵陽市等市州。青錢柳是一種食藥兩用植物，其葉、花、果均可入藥，其葉在食品加工領(lǐng)域中可作為新食品原料（中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會2013年第10號公告），食品加工領(lǐng)域一般用青錢柳葉加工成代用茶，我國湖南、江西等省份己有部分企業(yè)獲得青錢柳葉代用茶食品生產(chǎn)許可證。

現(xiàn)代藥學(xué)及食品加工業(yè)研究表明青錢柳葉中含有一定量的黃酮類化合物，并有一定的藥理活性。王克全等在青錢柳化學(xué)成分及藥理作用的研究進展，研究表明青錢柳中主要含有三萜皂苷、黃酮、甾體、萜類、有機酸、生物堿等類型成分，并且具有降血糖、降血脂、降血壓、增強免疫力、抗氧化和防衰老等藥理活性[1];張學(xué)英等在茶葉和3種代用茶總黃酮及9種單體化合物分析中研究表明青錢柳中含有綠原酸、異槲皮素等黃酮單體物質(zhì)[2]。經(jīng)查資料，青錢柳葉代用茶中黃酮及黃酮類化合物的檢測方法主要有分光光度計法、薄層色譜法、高效液相色譜法等，液相色譜法常用于黃酮單體的檢測，章發(fā)盛等研究了HPLC法同時測定青錢柳葉中綠原酸等4種多酚酸的含量[3];張學(xué)英等研究了高效液相色譜法同時測定青錢柳葉中異槲皮素等5種黃酮單體的含量研究[4];陳丹等研究了湖南綏寧青錢柳中槲皮素、山柰素含量測定[5] ;酈宏巖等研究了HPLC測定青錢柳中槲皮素和山柰素的含量[6]。經(jīng)查資料，黃酮單體檢測在樣品前處理過程中，一般處理步驟是“樣品中加入一定量的70%（或其他濃度）甲醇回流冷卻稱重，并加入純甲醇（或其他濃度）至回流前重量”[3-8]，但在實際操作過程中要求做到“衡重”存在一定弊端和難度，比如冷卻程度不徹底使衡重稱重不穩(wěn)、加入純甲醇至“衡重”操作控制難精準到位、長時間使用純甲醇對于檢測人員身體有一定傷害風(fēng)險（甲醇：CH3OH是結(jié)構(gòu)最為簡單的飽和一元醇，無色有酒精氣味易揮發(fā)的液體，分子量32.04，沸點64.7℃;甲醇對人體有強烈毒性，甲醇在人體新陳代謝中會氧化成比甲醇毒性更強的甲醛和甲酸，飲用含有甲醇的酒可引致失明、肝病、甚至死亡），應(yīng)盡量減少實驗步驟比如二次稱量，以減少工作量且提高檢測不確定度等。本試驗在樣品前處理過程中減少“加入純甲醇至回流前重量”操作步驟，引入校正系數(shù)F參與計算，并通過校正系數(shù)F驗證和樣品平行檢測分析比較，得出通過減少實驗步驟引入校正系數(shù)F方法的必要性、可行性和2種方法一致性。

1 試驗材料

1.1 儀器

試劑高效液相色譜儀器（安捷倫1260，帶自動進樣裝置，PAD檢測器）;BSA-224S分析天平;JY502電子天平;ZWT-H1-20超純水機;電熱恒溫水浴鍋;常用玻璃器皿等。甲醇（HPLC，含量≥99.9%）;乙腈（HPLC，含量≥99.9%）;乙醇（HPLC，含量≥99.8%）;磷酸;0.1%磷酸水溶液（自配）;超純水（自制）。

1.2 標準品

混合標準液本試驗用安譜實驗室技術(shù)（上海）有限公司生產(chǎn)的標準品，共9種黃酮單體標準品：蘆丁（CAS號153-18-4，純度99.3%）;異槲皮素（CAS號482-35-9，純度99.6%）;槲皮素（CAS號117-39-5，純度98.8%）;山奈素（CAS號491-54-3，純度99.5%）;山奈酚（CAS號520-18-3，純度98.9%）;新綠原酸（CAS號906-33-2，純度99.9%）;綠原酸（CAS號327-97-9，純度99.7%）;隱綠原酸（CAS號905-99-7，純度99.6%）;咖啡酸（CAS號331-39-5，純度98.1%）。配制成2種混合標準使用液：混標使用液1，濃度分別為蘆丁136ug/mL、異槲皮素82ug/mL、槲皮素64ug/mL、山奈酚70ug/mL和山奈素148ug/mL;混標使用液2，濃度分別為新綠原酸84ug/mL、綠原酸102ug/mL、隱綠原酸110ug/mL和咖啡酸64ug/mL。

1.3 試驗樣品

試驗樣品來源于湘食藥科[R201726]課題的科研樣品及青錢柳葉代用茶成品?？蒲袠悠窞?017-2018年春夏秋三季由科研人員野外現(xiàn)場采摘鮮葉，在試驗室內(nèi)加工制成。

2 試驗方法

2.1 樣品前處理方法

2.1.1 樣品前處理方法1（簡稱方法1）

準確稱取過60目篩青錢柳粉碎樣品約0.5g（準確至0.0001g）至250mL三角瓶中，準確加入30.0mL70%甲醇水溶液稱重記數(shù)，加裝回流裝置于80℃水浴鍋中恒溫回流2h，取出冷卻至室溫再次稱重，并用純甲醇補至回流前的重量（即衡重），混均過0.45μm濾膜，待上機[3-8]。

2.1.2 樣品前處理方法2（簡稱方法2）

準確稱取過60目篩青錢柳粉碎樣品約0.5g（樣品重M、準確至0.0001g）至250mL三角瓶中（空瓶重M0），準確加入30.0mL70%甲醇水溶液（稱重記數(shù)M'），加裝回流裝置于80℃水浴鍋中恒溫回流2h，取出冷卻至室溫再次稱重（再次稱重記數(shù)M"），混均過0.45μm濾膜，待上機。

2.2 液相色譜檢測條件及系統(tǒng)適用性

2.2.1 液相色譜檢測條件

色譜柱C18（4.6×250mm，5μm）;流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸水溶液，按流動相A（1～7分）10%→（7～13分）10%～16%→（13～14分）16%→（14～17分）16%～24%→（17～24分）24%→（24～32分）24%～50%→（32～45分）50%→（45～53分）10%時間和比例進行梯度洗脫;進樣量20ul;檢測柱溫30℃;檢測時間53min每針。

2.2.2 系統(tǒng)適用性

取異槲皮素等5種混合標液1及單一標準品，用高效液相色譜儀PAD檢測器進行三維掃描光譜分析，混合標液1色譜圖見圖1，其它檢測數(shù)據(jù)及分析見表1。

通過三維掃描圖譜分析，異槲皮素等5種黃酮單體在360nm處色譜圖響應(yīng)值最大、基線平穩(wěn)、峰形好，故360nm為5種黃酮單體檢測波長[4]。從圖1和表1可見異槲皮素等5種黃酮單體分離效果很好，理論塔板數(shù)均遠遠大于4000;分離度均遠遠大于1.5;標準系列線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均很接近1。證明液相色譜檢測系統(tǒng)適用性良好。

另取綠原酸等4種混合標液2及單一標準品，用高效液相色譜儀PAD檢測器進行三維掃描，混合標液2色譜圖見圖2、其它檢測數(shù)據(jù)及分析見表2。

通過三維掃描圖譜分析，綠原酸等4種多酚酸在326nm處色譜圖響應(yīng)值最大、基線平穩(wěn)、峰形好，確定326nm為4種多酚酸檢測波長[5]。從圖2和表2可見綠原酸等4多酚酸分離效果好，理論塔板數(shù)均遠遠大于4000;分離度均大于1.5;標準系列線性回歸方程相關(guān)系數(shù)為1或很接近1。證明液相色譜檢測系統(tǒng)適用性良好。

3 校正系數(shù)F及驗證

3.1 相關(guān)試劑

室溫環(huán)境下測定相關(guān)試劑的密度，檢測數(shù)據(jù)及分析見表3至表5。

由表3可見超純水（自制）平均密度為1.0057g/mL，RSD值為0.41%;由表4可見色譜純無水甲醇平均密度為0.7890g/mL，RSD值為0.19%，同時檢測值與理論值的相對誤差0.35%遠小于10%;由表5可見70%甲醇水溶液平均密度為0.8545g/mL，RSD值為0.22%，同時檢測值與理論值的相對誤差9.6%小于10%，綜上分析本試驗所用相關(guān)試劑均理想。

從以上2個計算實例分析，可見回流過程跑走純甲醇量比例為7.61%和3.92%，均小于10%，說明回流過程中跑走的純甲醇量比例較小，并不影響整個試驗合理性;2個計算實例Fv與Fm相對誤差值為0.17%和0.45%，均遠遠小于5%，說明2種系數(shù)驗證法計算結(jié)果很接近且能相互驗證一致性;比較2種驗證法計算難易程度Fv比Fm難些，但從一般樣品前處理定容檢驗步驟的理解Fv比Fm更易于理解，因為檢驗檢測“定溶”一般以液體體積為準，而本試驗是以“質(zhì)量定容”為準。綜合以上分析以Fm應(yīng)用于本試驗校正系數(shù)，且通過Fv和Fm驗證試驗可行性和一致性。

3.4 2種方法的檢測結(jié)果分析

比較用2種方法檢測同一樣品（n=5），所得樣品重現(xiàn)性檢測數(shù)據(jù)及結(jié)果分析，見表6。

從表6分析可見，用2種前處理方法檢測9種黃酮單體物質(zhì)，其中檢出的6種目標物RSD值（n=5）1.35%～4.48%，均小于5%，說明2種前處理B方法檢測結(jié)果相符即2種前處理方法的一致性。

4 結(jié)論

方法1在實際操作過程中要求做到“衡重”存在一定弊端和難度：比如液體冷卻程度不徹底或液體固有揮發(fā)性使稱重不穩(wěn);加入純甲醇至“衡重”操作控制難精確到位;長時間使用純甲醇對于檢測人員身體有一定傷害風(fēng)險;宜盡量減少實驗步驟比如二次稱量，以減少工作量且提高檢測不確定度等（即方法2必要性）;方法2通過減少實驗步驟引入校正系數(shù)法，從而減少實驗工作量及實驗安全性，提高檢測不確定度。分析純甲醇的毒性、減少不確定度因素提高不確定度及減少實驗過程工作量等考慮因素提出方法2的必要性;通過對Fv與Fm計算及驗證，兩例實例計算Fv與Fm相對誤差值0.17%和0.45%，均遠遠小于5%，得出方法2檢驗的可行性和一致性;通過分析比較2種方法6種檢測目標物的RSD值（n=5）1.35%～4.48%，均小于5%，得出2種檢驗方法結(jié)果的一致性。

參考文獻

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[4]張學(xué)英，章發(fā)盛.高效液相色譜法同時測定青錢柳葉中異槲皮素等5種黃酮單體的含量研究[J].中國標準化，2019（02）：153-157.

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[6]酈宏巖，朱惠芬.HPLC測定青錢柳中槲皮素和山柰素的含量[J].藥學(xué)與臨床研，2009（04）：300-302.

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[8]李春娜，范冰舵.HPLC-DAD波長切換法同時測定青錢柳提取物中5種有效成分[J].遼寧中醫(yī)雜志，2015，42（6）：1283-1285.