畢靜瑩，李 華*，王 華*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物與制藥技術(shù)系，寧夏 銀川 750021）

柑橘屬（Citrus L.）為無患子目蕓香科類植物，是橘、柑、橙、金柑、枳、柚等的總稱。柑橘及其制品中的苦味早已為人們所熟知，其苦味主要由兩類具有抑癌活性的物質(zhì)提供，一類是以檸檬苦素和諾米林為代表的高度氧化的四環(huán)三萜類次生代謝產(chǎn)物檸檬苦素類似物；另一類是以柚皮苷為代表的黃酮類物質(zhì)[1-4]。檸檬苦素類似物主要通過清除自由基[5]、激發(fā)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性[6]、抑制致癌化學(xué)物質(zhì)活性[7-9]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖[10]等途徑防治腫瘤，能明顯抑制神經(jīng)瘤[5]、肝癌[11-13]、皮膚癌、乳腺癌、結(jié)腸癌[14]、肺癌及胃癌等的發(fā)生，尤其能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞株（HL60）中凋亡蛋白酶依賴的細(xì)胞死亡[15]；柚皮苷通過在癌細(xì)胞的DNA鏈形成時阻止癌細(xì)胞DNA鏈的合成、在癌細(xì)胞DNA鏈延長時剪切或縮短DNA鏈，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；對人淋巴細(xì)胞白血病、肝癌[16]、乳腺癌[17]、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌[18]等多種癌細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用。

宮頸癌是發(fā)展中國家發(fā)生率僅次于乳腺癌的惡性腫瘤疾病，占總癌癥發(fā)生率的11%，每年宮頸癌新病例超50萬，而85%發(fā)生在發(fā)展中國家[19]。正常生理活動下細(xì)胞增殖與凋亡處于動態(tài)平衡中，而惡性腫瘤是機(jī)體細(xì)胞過度增殖而引起的疾病，其嚴(yán)重程度取決于癌細(xì)胞發(fā)生部位、惡化程度及是否轉(zhuǎn)移，因此研究癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移是治療癌癥的關(guān)鍵。

鑒于柚類種子和白色海綿層中檸檬苦素類似物[20]和柚皮苷[21]含量較高，故本研究選擇‘高臺’蜜柚這兩部分進(jìn)行檸檬苦素、諾米林和柚皮苷3 種苦味物質(zhì)的提取、純化和超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）檢測。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)并結(jié)合文獻(xiàn)[22-23]報(bào)道，發(fā)現(xiàn)3 種苦味物質(zhì)在50 μmol/L時對癌細(xì)胞均有顯著的抑制作用，因此本研究均選用50 μmol/L濃度的這3 種苦味物質(zhì)對宮頸癌HeLa細(xì)胞進(jìn)行處理，利用細(xì)胞增殖檢測（cell counting kit-8，CCK-8）、細(xì)胞劃痕和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）實(shí)驗(yàn)研究3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，以驗(yàn)證其作用效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮完熟的‘高臺’蜜柚，2017年12月中下旬采于四川渠縣，取其種子和白色海綿層（切成1 cm左右的薄片），于50 ℃烘干，恒質(zhì)量后粉碎機(jī)處理，分別過60、40 目篩備用。

HeLa細(xì)胞株由西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并保存。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）索萊寶生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 浙江天杭生物科技股份有限公司；青鏈霉素溶液、杜氏培養(yǎng)液（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）/高糖（high-glucose，HG）培養(yǎng)基、胰蛋白酶溶液 美國Hyclone公司；檸檬苦素、諾米林和柚皮苷（均為色譜純）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；SYBR Green qPCR Master Mix、PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒 TaKaRa生物技術(shù)（北京）有限公司；RNase-Free ddH2O 生工生物工程（上海）股份有限公司；CCK-8試劑盒 諾唯贊生物科技有限公司；TRIzol試劑 天根生化科技有限公司；氯仿、異丙醇、無水乙醇（均為分析純） 四川西隴化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；Vortex-Genie 2多功能漩渦混合器 美國Scientific Industries公司；Cary 60 UV-Vis紫外分光光度計(jì)安捷倫科技有限公司；5804R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；ICX41倒置熒光顯微鏡 舜宇光學(xué)科技（集團(tuán)）有限公司；MicroCL 21R離心機(jī) 美國Thermo Scientific公司；IQ5實(shí)時熒光定量PCR儀 美國伯樂公司；LightCycler?480實(shí)時熒光定量PCR儀 瑞士羅氏公司；UPLC I-Class UPLC（配有二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）） 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 苦味物質(zhì)的提取、純化

1.3.1.1 檸檬苦素和諾米林的提取和純化

檸檬苦素和諾米林的提取參照孟鵬等[24]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。取柚子種子粉末10.0 g，于索氏提取器中用石油醚（沸程60～90 ℃）60 ℃水浴回流脫脂至無色，過濾。按照料液比1∶20加入三氯甲烷，超聲波250 W輔助提取45 min，過濾后10 000 r/min、10 ℃離心10 min，上清液40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加色譜甲醇定容至10 mL，0.22 μm濾膜過濾后按照孟鵬[25]的方法進(jìn)行檸檬苦素和諾米林的重結(jié)晶純化。

1.3.1.2 柚皮苷的提取和純化

柚皮苷的提取參照周石磊等[26]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。取白色海綿層粉末10.0 g置于錐形瓶中，以料液比1∶25（m/V）加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶液，250 W超聲波60 ℃輔助提取60 min，提取液過濾后10 000 r/min、10 ℃離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后按照賈冬英[27]的方法進(jìn)行柚皮苷的重結(jié)晶純化。

1.3.1.3 提取率和純度的計(jì)算

提取率和純度分別按式（1）、（2）計(jì)算。

1.3.2 苦味物質(zhì)的UPLC分析

UPLC條件參考NY/T 2011—2011《柑橘類水果及制品中檸堿含量的測定》、NY/T 2014—2011《柑橘類水果及制品中橙皮苷、柚皮苷含量的測定》和孟鵬等[24]的方法進(jìn)行檢測分析，并進(jìn)行改進(jìn)。檸檬苦素和諾米林：流動相為乙腈-水（體積比為45∶55），等度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長215 nm，進(jìn)樣量1.0 μL；柚皮苷：流動相為甲醇-水（體積比為40∶60），檢測波長283 nm，其他條件同檸檬苦素和諾米林。

1.3.3 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)及苦味物質(zhì)對其增殖的影響

1.3.3.1 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞復(fù)蘇：HeLa細(xì)胞株液氮取出后，在37 ℃恒溫水浴鍋中快速解凍，輕輕搖晃凍存管使其在1 min內(nèi)融化，體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇溶液擦拭凍存管后移至無菌操作臺，凍存管內(nèi)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，1 500 r/min室溫下離心2 min，棄培養(yǎng)基，用1 mL含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至100 mm培養(yǎng)皿中，加入適量體積分?jǐn)?shù)10% FBS、1%雙抗培養(yǎng)基高糖培養(yǎng)基中，上下?lián)u晃使細(xì)胞均勻分布后放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代：在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時，細(xì)胞需要進(jìn)行傳代。細(xì)胞棄原培養(yǎng)基，并用PBS洗滌細(xì)胞2～3 次后加入體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶溶液，37 ℃消化至顯微鏡下細(xì)胞變圓后用槍頭反復(fù)吸打培養(yǎng)皿底部至細(xì)胞懸浮，立即加入含血清培養(yǎng)基終止消化，并將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，1 500 r/min室溫下離心2 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次后重懸細(xì)胞并接種至3 個同尺寸培養(yǎng)皿中。

細(xì)胞凍存：細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期時棄培養(yǎng)基，加入體積分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶溶液消化并用離心管收集細(xì)胞，并用凍存培養(yǎng)基（V（DMSO）∶V（FBS）∶V（DMEM/HG）＝1∶2∶7）重懸細(xì)胞至細(xì)胞濃度為1×106～5×106個/mL后移入凍存管中，封口后標(biāo)注細(xì)胞名稱和日期，用凍存盒凍存。

1.3.3.2 CCK-8試劑盒檢測3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞增殖的影響

HeLa細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期時，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞兩次，用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶溶液將HeLa細(xì)胞從培養(yǎng)皿上消化下來，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS、1%雙抗高糖培養(yǎng)基配成細(xì)胞密度為5×105個/mL的單細(xì)胞懸液，在96 孔板中，每孔加入100 μL單細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后分別加入柚皮苷、檸檬苦素和諾米林，使得3 種物質(zhì)終濃度為50 μmol/L，每個組設(shè)置5 個復(fù)孔。處理0 h和24 h后，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌兩次，每孔加入5 μL CCK-8和95 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長條件下測定OD值。對照組不添加苦味物質(zhì)，空白組不添加單細(xì)胞懸液，細(xì)胞抑制率按公式（3）進(jìn)行計(jì)算。

1.3.3.3 RT-PCR檢測3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫人基因序列，采用Primer 5.0軟件和NEB Tm Calculator軟件設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物，交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

表1 RT-PCR擴(kuò)增引物信息Table 1 Primer information of quantitative RT-PCR amplification

3 種苦味物質(zhì)處理細(xì)胞24 h后，回收細(xì)胞，利用柱式動物組織總RNA抽提純化試劑盒進(jìn)行RNA的提取，利用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄。采用表1所設(shè)計(jì)的引物，使用對經(jīng)3 種苦味物質(zhì)處理后的HeLa細(xì)胞的Fas、Caspase-9、Caspase-8等基因的相對表達(dá)量進(jìn)行RT-PCR檢測。RT-PCR反應(yīng)體系如下：SYBR Green qPCR Master Mix 7.5 μL、Primer-F 1 μL、Primer-R 1 μL、cDNA 2 μL、RNase Free ddH2O 3.5 μL。RT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40 個循環(huán)。

1.3.3.4 細(xì)胞劃痕檢測3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞遷移的影響

取對數(shù)期生長的HeLa細(xì)胞，棄上清液，加PBS洗滌細(xì)胞兩次后使用體積分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)為10% FBS的DMEM/HG培養(yǎng)基配成細(xì)胞密度為5×105個/mL的單細(xì)胞懸液，6 孔板每孔加入3 mL單細(xì)胞懸液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待匯合度達(dá)到80%時，用槍頭在皿中劃“#”，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌3 次后分別加入50 μmol/L柚皮苷、檸檬苦素和諾米林的無血清培養(yǎng)基。并設(shè)置空白組（DMSO+無血清培養(yǎng)基），處理0、24 h和48 h后于顯微鏡下拍照，每組設(shè)5 個重復(fù)。

細(xì)胞遷移圖片數(shù)據(jù)處理采用Image J軟件，相對遷移率按照公式（4）進(jìn)行計(jì)算。

式中：S0、St分別表示0、t/h時的劃痕面積/m2。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算，差異顯著性分析采用SPSS軟件的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦味物質(zhì)的檢測

表2為3 種苦味物質(zhì)的線性范圍及回歸方程。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可知，檸檬苦素、諾米林和柚皮苷的線性關(guān)系決定系數(shù)范圍在0.996 4～0.999 7，說明在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。本實(shí)驗(yàn)檸檬苦素類似物的提取率為5.21 mg/g。檸檬苦素和諾米林的純度分別為94.08%和93.91%；柚皮苷的提取率為7.72 mg/g，純度為93.39%。

表2 檸檬苦素、諾米林和柚皮苷的線性范圍及回歸方程Table 2 Linear ranges and regression equations for calibration curves of limonin, nomilin and naringin

2.2 3 種苦味物質(zhì)抑癌活性研究

2.2.1 3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞增殖的影響

50 μmol/L的柚皮苷和諾米林處理HeLa細(xì)胞24 h后能明顯抑制HeLa細(xì)胞增殖，細(xì)胞抑制率分別為（8.05±1.25）%和（4.16±1.35）%；同時，可觀察到處理組培養(yǎng)液中均出現(xiàn)漂浮的死細(xì)胞。而檸檬苦素對HeLa細(xì)胞抑制率較小，僅為（2.13±0.84）%。

2.2.2 3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

由圖1可知，經(jīng)過檸檬苦素處理HeLa細(xì)胞24 h后，與對照組相比，Bax基因表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），Bcl-2基因表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；HeLa細(xì)胞經(jīng)過柚皮苷處理24 h后Bax基因表達(dá)量較對照組極顯著增加（P＜0.01）；HeLa細(xì)胞經(jīng)過柚皮苷、檸檬苦素和諾米林處理24 h后TNFR1基因表達(dá)量較對照組有明顯的增長趨勢，而Casepase-8基因表達(dá)量較對照組無明顯變化。此外，經(jīng)這3 種物質(zhì)處理HeLa細(xì)胞24 h后，Caspase-9、Caspase-3、Fas、Cytochrome c基因表達(dá)量與對照組相比均無顯著變化（此部分?jǐn)?shù)據(jù)和圖未呈現(xiàn)）。

圖1 3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞Bax（A）、Bcl-2（B）、TNFR1（C）、Caspase-8（D）基因相對表達(dá)量的影響Fig. 1 Effects of three bitter substances on relative expression levels of Bax (A), Bcl-2 (B), TNFR1 (C) and Caspase-8 (D) in HeLa cells

2.2.3 3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞遷移的影響

圖2 3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞遷移的抑制Fig. 2 Three bitter substances inhibited HeLa cells migration

圖3 3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞相對遷移率的影響Fig. 3 Effects of the three bitter substances on relative mobility of HeLa cells

圖2 、3細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞遷移的抑制和相對遷移率的影響。諾米林處理HeLa細(xì)胞24 h和48 h后，HeLa細(xì)胞相對遷移率極顯著降低（P＜0.01），表明諾米林顯著降低了HeLa細(xì)胞的遷移能力（圖2中50 μmol/L諾米林處理24、48 h和圖3C）。檸檬苦素處理HeLa細(xì)胞24 h后，對照組遷移距離較實(shí)驗(yàn)組遠(yuǎn)（圖2中50 μmol/L檸檬苦素處理24 h），HeLa細(xì)胞相對遷移率極顯著降低（P＜0.01），但48 h后HeLa細(xì)胞遷移能力較對照組沒有顯著差異（圖3A），可能是培養(yǎng)基中有血清導(dǎo)致結(jié)果受到增殖的影響。柚皮苷處理HeLa細(xì)胞24 h和48 h后，HeLa細(xì)胞相對遷移率極顯著降低（P＜0.01）（圖2中50 μmol/L柚皮苷處理24、48 h和圖3B），因此，柚皮苷顯著降低了HeLa細(xì)胞的遷移能力。

3 討 論

本研究以高臺蜜柚種子和白色海綿層為原料，分別進(jìn)行檸檬苦素、諾米林和柚皮苷的提取、分離純化和檢測。檸檬苦素類似物和柚皮苷的提取率分別為5.21 mg/g和7.72 mg/g，檸檬苦素、諾米林和柚皮苷的純度分別為94.08%、93.91%和93.39%。

檸檬苦素、諾米林和柚皮苷均選擇50 μmol/L工作濃度，通過體外培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，研究其對HeLa細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響，以不同方式探討3 種苦味物質(zhì)對HeLa細(xì)胞的作用機(jī)制：柚皮苷和檸檬苦素均能顯著促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，柚皮苷和諾米林均能抑制HeLa細(xì)胞增殖，3 種苦味物質(zhì)均能顯著抑制HeLa細(xì)胞遷移。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，柑橘及其制品中的苦味物質(zhì)對不同癌細(xì)胞的增殖均有顯著抑制作用。宋淑慧等發(fā)現(xiàn)40 μmol/L柚皮苷能抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株增殖，猜測是通過下調(diào)COX-2 mRNA及其蛋白表達(dá)而達(dá)到抗腫瘤作用[22]。胡昕等除了發(fā)現(xiàn)40 μmol/L柚皮苷對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞株增殖的顯著抑制作用外，還發(fā)現(xiàn)其促使P38 MARK和ERK1/2蛋白表達(dá)下調(diào)[23]。鄒連生發(fā)現(xiàn)檸檬苦素類似物顯著抑制人肝癌和膀胱癌細(xì)胞株的增殖，諾米林的抑制率優(yōu)于檸檬苦素，且呈時間-劑量依賴效應(yīng)，同時對正常體細(xì)胞無毒害作用[28]。唐莉莉等發(fā)現(xiàn)30 mg/mL檸檬苦素能通過影響MCF-7細(xì)胞周期抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[29]。張娟娟等發(fā)現(xiàn)2.5 μg/mL檸檬苦素能有效抑制人肝癌細(xì)胞株的增殖[12]。大量研究證明3 種苦味物質(zhì)對癌細(xì)胞增殖有抑制作用，本研究通過CCK-8實(shí)驗(yàn)證明了3 種苦味物質(zhì)對宮頸癌細(xì)胞增殖的影響，柚皮苷和諾米林作用24 h后能明顯抑制HeLa細(xì)胞增殖，而檸檬苦素抑制作用較弱，不同的檸檬苦素類似物對同一癌細(xì)胞的作用效果是有較大差異的。1989年Lam等證明了諾米林在肝臟和小腸黏膜通過誘導(dǎo)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性從而抑制致癌物質(zhì)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的效果明顯，而檸檬苦素的作用較弱[11]。但是Miller等發(fā)現(xiàn)檸檬苦素對口腔癌和皮膚癌的抑制效果卻顯著高于諾米林，目前較為認(rèn)可的解釋是呋喃環(huán)在其中發(fā)揮作用，但是其具體作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究[7]。

目前，還有部分學(xué)者從促凋亡方向?qū)? 種苦味物質(zhì)的抑癌效果進(jìn)行研究。張春艷發(fā)現(xiàn)柚皮苷能通過抑制增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)，C4’—OCH3基團(tuán)在抑制HepG-2細(xì)胞增殖中發(fā)揮了重要作用[30]。Yeh等發(fā)現(xiàn)柚皮苷能有效抑制致癌物質(zhì)對遺傳物質(zhì)的破壞作用[31]。柚皮苷通過減少腫瘤壞死因子的釋放，抑制細(xì)胞壁中的脂多糖釋放從而毒害正常細(xì)胞，從而能減少致癌物質(zhì)對正常體細(xì)胞破壞，維持細(xì)胞內(nèi)遺傳基因穩(wěn)定[32]。為探究3 種苦味物質(zhì)抑制癌癥的作用機(jī)制，本研究利用實(shí)時定量PCR實(shí)驗(yàn)，對Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、TNFR1、Fas、Cytochrome c基因表達(dá)量進(jìn)行了檢測。檸檬苦素作用于HeLa細(xì)胞24 h后基因Bcl-2、Bax表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），柚皮苷作用于HeLa細(xì)胞后基因Bcl-2表達(dá)量極顯著增加（P＜0.01），證明柚皮苷有可能通過內(nèi)源性途徑抑制細(xì)胞凋亡。同時，死亡受體基因TNFR1表達(dá)量有明顯上升趨勢，可能是其外源性凋亡途徑也發(fā)揮了作用；Caspase-8表達(dá)量無明顯變化，因此TNFR1不是通過激活Caspase-8而調(diào)控外源性凋亡途徑的，而有可能通過激活TNK/AP-1途徑達(dá)到外源促凋亡作用。在研究過程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過3 種苦味物質(zhì)處理后，HeLa細(xì)胞的遷移速率可能變慢，為了證明猜測，進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)3 種苦味物質(zhì)均能極顯著抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。癌細(xì)胞擴(kuò)散是癌癥治療過程中一大難題，其會導(dǎo)致病征的嚴(yán)重，因此如何控制癌細(xì)胞擴(kuò)散和減緩細(xì)胞遷移速率至關(guān)重要。本研究中還發(fā)現(xiàn)苦味物質(zhì)作用后癌細(xì)胞貼壁較弱，形態(tài)發(fā)生較大變化，活性降低，這也是細(xì)胞遷移能力顯著減弱的具體體現(xiàn)。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，柑橘及其制品中3 種苦味物質(zhì)檸檬苦素、諾米林和柚皮苷對宮頸癌HeLa細(xì)胞具有明顯的抑制增殖和促凋亡作用，能夠作為一種潛在的抑制癌癥的藥物原材料進(jìn)行開發(fā)和研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為今后的相關(guān)探索提供一定的數(shù)據(jù)支持。