賈 聰，蘆 鑫，高錦鴻,2，孫 強(qiáng),2，朱笑鵬，王 強(qiáng)，黃紀(jì)念,4,*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省農(nóng)產(chǎn)品生物活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部油料加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430062）

花生是具有很高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的豆科植物[1]，種植面積僅次于油菜，居世界油料作物第二位[2]。我國(guó)生產(chǎn)的花生45%～50%被用于榨油，其他用以制作花生食品（花生醬、花生飲料、油炸花生仁等）。花生紅衣是花生加工生產(chǎn)后的副產(chǎn)物，但其常作為廢棄物直接被丟棄或用作動(dòng)物飼料，資源未得到充分利用[3]。

中醫(yī)認(rèn)為花生紅衣味甘、微苦、性平，主治止血、散淤、消腫，具有極大的藥用價(jià)值[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，花生紅衣中原花青素可以降低小腸吸收膽固醇，緩解動(dòng)脈粥樣硬化[5-6]。利用花生紅衣萃取液精制而成的注射液應(yīng)用于血友病、血小板減少癥紫癜、肝臟出血、術(shù)后出血后，80%以上病例具有令人滿意的止血效果[7-8]。花生紅衣由于其可食用性，還可作為功能因子用于糖和飲料中[9-10]。因此，花生紅衣具有廣闊的應(yīng)用前景。

然而對(duì)花生紅衣的研究起步較晚，已有研究表明花生紅衣中含有豐富的多酚類化合物，如白藜蘆醇、原花青素、黃酮類色素等物質(zhì)[11]。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，花生紅衣中的含量約為0.65 mg/g[12]，具有抗炎、抗過敏、保肝利肝等生理功能[13]。原花青素屬于黃酮醇類化合物，花生紅衣中的原花青素抗氧化活性較強(qiáng)[14]，較白藜蘆醇和抗壞血酸具有更強(qiáng)的清除自由基的能力[15]。黃酮類色素是以黃酮為母核而衍生的一類黃色色素，具有抗腫瘤、保護(hù)心血管系統(tǒng)、延緩衰老等作用[16]。我國(guó)的花生種類繁多，不同品種的花生在外觀、組分及性質(zhì)上有明顯差異[17]，其花生紅衣的組成也存在差異，目前已有的研究并未系統(tǒng)深入討論花生紅衣代謝層面的差異。代謝組學(xué)主要對(duì)生物體內(nèi)代謝小分子和代謝網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)調(diào)控進(jìn)行全局性分析[18]，作為一種新興的研究手段，該技術(shù)已成功應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)學(xué)、毒理學(xué)、疾病診斷等各個(gè)領(lǐng)域[19-20]。采用代謝組學(xué)可快速全面分析花生紅衣中多種具有生物活性代謝物的含量變化，有利于科學(xué)評(píng)估花生紅衣的應(yīng)用價(jià)值，為花生紅衣的質(zhì)量控制及花生種源選育提供參考。

因此，本實(shí)驗(yàn)選取3 種具有明顯顏色差異的花生紅衣作為研究對(duì)象，采用非靶向代謝組學(xué)分析不同花生紅衣品種間的差異代謝物，并對(duì)差異代謝通路進(jìn)行富集，以揭示不同顏色花生紅衣代謝差異性，以期為花生紅衣的加工應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生品種（圖1）分別為‘冀花4號(hào)’（L*＝44.30、a*＝20.62、b*＝2.46）、‘四粒紅’（L*＝31.70、a*＝22.48、b*＝15.26）、‘國(guó)育2016’（L*＝20.19、a*＝7.93、b*＝2.46），由河南綠色作物研究中心提供；花生經(jīng)去紅衣機(jī)分離并收集紅衣。

甲醇、甲酸、水、乙腈（色譜級(jí)） 德國(guó)CNW公司；L-2-氯苯丙氨酸（分析純） 上海恒創(chuàng)生物科技有限公司。

圖1 花生品種外觀Fig. 1 Photographs of peanut cultivars with varying skin colors

1.2 儀器與設(shè)備

JXFSTPRP-24/32全自動(dòng)樣品快速研磨儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；TYXH-I漩渦振蕩器 上海汗諾儀器有限公司；TGL-16MS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；SB-5200DT超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；Acquity UPLC超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）儀、Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm） 美國(guó)沃特世科技有限公司；Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 花生紅衣的前處理

稱取80 mg花生紅衣，加入內(nèi)標(biāo)（用甲醇分別配制0.3 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸和0.01 mg/mL十七烷烴）各20 μL和1 mL提取劑（體積分?jǐn)?shù)80%甲醇溶液，含0.01 mol/L 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸溶液）；在-20 ℃放置2 min預(yù)冷，加入研磨機(jī)60 Hz處理2 min；超聲提取30 min（4 ℃）；-20 ℃靜置20 min；離心15 min（13 000 r/min、4 ℃），用注射器吸取200 μL上清液，使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到液相進(jìn)樣小瓶，-80 ℃下保存，待進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析。所有提取試劑使用前均在-20 ℃進(jìn)行預(yù)冷。

1.3.2 液相色譜分析條件

色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：45 ℃；流動(dòng)相A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-水溶液、流動(dòng)相B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸-乙腈溶液；梯度洗脫條件為0～2 min：95% A；2～4 min：80% A；4～9 min：75% A；9～17 min：40% A；17～19 min：0% A；19～20 min：95% A；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.3.3 質(zhì)譜分析條件

采用電噴霧離子源，樣品質(zhì)譜信號(hào)采集分別采用正負(fù)離子掃描模式，條件如表1所示。

表1 分析花生紅衣組分的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for component analysis of peanut skins

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

將花生紅衣樣品分為3 組并分別進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，第1組為‘冀花4號(hào)’，第2組為‘四粒紅’，第3組為‘國(guó)育2016’。3 組樣品之間的對(duì)比分別記為2/1、3/1、3/2，其中2/1表示‘四粒紅’與‘冀花4號(hào)’之間的代謝物比較，3/1和3/2以此類推。

所有樣品在正負(fù)離子模式下的總離子流圖經(jīng)代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI進(jìn)行基線過濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化，得到一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)荷比（m/z）和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA軟件包，并進(jìn)行無監(jiān)督的主成分分析（principal component analysis，PCA）和有監(jiān)督的（正交）偏最小二乘法（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）分析，依據(jù)OPLS-DA模型第一主成分的變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值＞1.0、t檢驗(yàn)的P＜0.05來篩選組間的差異代謝物[21]。代謝物主要依據(jù)其色譜峰保留時(shí)間及質(zhì)荷比（m/z），用Progenesis QI代謝處理軟件基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.hmdb.ca/和http://www.lipidmaps.org/）及上海鹿明生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性。利用KEGG（http://www.genome.jp/KEGG/pathway.html）代謝途徑對(duì)差異代謝物的代謝通路進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種花生紅衣的PCA

通過對(duì)所有花生紅衣樣品的基峰色譜圖進(jìn)行可視化檢查，發(fā)現(xiàn)所有樣品的儀器分析均信號(hào)強(qiáng)、峰容量大且保留時(shí)間重現(xiàn)性好?！交?號(hào)’、‘四粒紅’和‘國(guó)育2016’這3 種花生紅衣的正負(fù)離子模式下的總離子流圖如圖2所示。

圖2 花生紅衣的負(fù)離子模式（A、B、C）和正離子模式（D、E、F）總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms in negative ion model (A, B and C) and in positive ion model (D, E and F) of peanut skins

利用SIMCA軟件將圖1的數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行無監(jiān)督的PCA，得到花生紅衣的PCA得分圖（圖3）。從圖3可以看出，3 組花生紅衣的數(shù)據(jù)點(diǎn)在得分圖上可以明顯區(qū)分，‘冀花4號(hào)’位于第三象限內(nèi)，‘四粒紅’位于第四象限內(nèi)，‘國(guó)育2016’位于第二象限內(nèi)，表明3 組花生紅衣樣品中的代謝物存在明顯差異（代謝物數(shù)量、濃度、種類等）[22-23]。由圖3可知，每組花生紅衣樣品的3 次生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)能夠很好地集中在一起，說明在實(shí)驗(yàn)過程中數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好，代謝組組間的分析數(shù)據(jù)可信度較高[23]。

圖3 花生紅衣的PCA得分圖Fig. 3 PCA score plots for peanut skins with different colors

2.2 差異代謝物的熱圖分析

表2 花生紅衣的顯著差異代謝物Table 2 Significantly differential metabolites of peanut red skins with different colors

采用多維分析和單維分析相結(jié)合的方法，根據(jù)OPLS-DA生成的VIP值來篩選組間差異代謝物（VIP＞1）。VIP值越大，說明該差異代謝物對(duì)樣品組間的分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力越強(qiáng)[24]。對(duì)‘冀花4號(hào)’、‘四粒紅’和‘國(guó)育2016’分別進(jìn)行組間分析比較，發(fā)現(xiàn)3 組樣品中均存在的差異代謝物共有218 個(gè)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)組間具有較顯著差異的代謝物進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最終得到16 種差異代謝物（VIP＞5），如表2所示，主要包括黃酮類、黃酮醇類、有機(jī)酸類、酯類、肽類、酚類等。已有報(bào)道指出花生紅衣含有黃酮類物質(zhì)（毛地黃黃酮、蘆丁、異鼠李黃素配糖體等）[8]、酚酸類物質(zhì)（阿魏酸、綠原酸、對(duì)香豆酸等）[25]以及多酚物質(zhì)（原花色素、白藜蘆醇等）[26]等。Lou Hongxiang等[27]分離花生紅衣中的多酚物質(zhì)，鑒定其結(jié)構(gòu)為表兒茶素-(2β→O→7,4β→6)-兒茶素和表兒茶素-(4α→8)-沒食子兒茶素-(4α→8)-兒茶素等。而采用代謝組學(xué)分析花生紅衣，鑒定出其中含有的小分子物質(zhì)種類更加豐富、全面，從而為后續(xù)花生紅衣代謝物分析結(jié)果的準(zhǔn)確性提供有利的數(shù)據(jù)支撐。

采用聚類熱圖對(duì)16 種差異代謝物在不同花生紅衣品種中的分布情況進(jìn)行分析。從圖4可以看出，顏色較深的花生紅衣（‘四粒紅’和‘國(guó)育2016’）含有的山柰酚和表兒茶素-(4α→8)-沒食子兒茶素-(4α→8)-兒茶素明顯較多，且隨著紅衣顏色的加深，原花青素、楊梅素和槲皮素含量明顯增高。相比于顏色較淺的花生紅衣，顏色較深的花生紅衣中含量較高的差異代謝物主要包括酚類、黃酮類和黃酮醇類化合物，其具有一定的藥理保健作用（如抗氧化、抗炎、防衰老等）[25]，有利于調(diào)節(jié)人體免疫機(jī)能[24]；因此顏色較深的花生紅衣是治療慢性疾病的理想選擇，具有廣闊的開發(fā)前景。對(duì)這16 種差異代謝物的相關(guān)性進(jìn)行聚類分析，根據(jù)相關(guān)系數(shù)可以將其分為3 組（圖4），第1組包括原花青素、楊梅素和槲皮素，第2組包括蘆丁，其余12 種差異代謝物歸為第3組。

圖4 花生紅衣品種間顯著差異代謝物的熱圖分析Fig. 4 Heat map analysis of differential metabolites in peanut skins from different cultivars

2.3 差異代謝物的代謝通路分析

圖5 花生紅衣差異代謝物參與代謝通路富集圖Fig. 5 Enrichment of differential metabolites in metabolic pathways

圖6 花生紅衣的黃酮和黃酮醇生物合成代謝通路（‘四粒紅’與‘冀花4號(hào)’對(duì)比分析）Fig. 6 Flavone and flavonol biosynthesis pathways in peanut skins (comparison between ‘Silihong’ and ‘Jihua 4’)

通過MBRole通路分析功能，利用差異代謝物的KEGG ID進(jìn)行通路富集分析。由圖5可知，這16 種差異代謝物參與的代謝途徑有10 條，P＜0.05表示差異顯著，P值越小，則該代謝通路的差異性越顯著，圖5中P＜0.05的代謝途徑有4 條，分別是黃酮和黃酮醇生物合成、類黃酮生物合成、磷脂代謝和線粒體中的脂肪酸伸長(zhǎng)，其中黃酮和黃酮醇生物合成途徑最為顯著（P最?。?。參與黃酮和黃酮醇生物合成代謝通路的有4 個(gè)差異代謝物，分別是山柰酚、槲皮素、楊梅素和蘆丁。山柰酚是一種多酚類抗氧化物，屬于黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌和保肝等功效[28]。槲皮素也是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抗病毒、抗炎等多重生理活性，可用來治療肝、心、脾、肺、腎、骨科等疾病[29]。楊梅素屬于黃酮醇類化合物，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖、保肝和抗氧化等多種藥理活性，尤其在防治心血管疾病方面作用明顯[30-31]。蘆丁屬于黃酮類化合物，具有抗紫外線、抗炎、抗病毒及恢復(fù)毛細(xì)血管正常彈性等多種生理活性，臨床上可用于防治腦溢血、視網(wǎng)膜出血等[32-33]。將‘四粒紅’與‘冀花4號(hào)’對(duì)比分析，‘四粒紅’的山柰酚在黃酮和黃酮醇生物合成通路中代謝旺盛，而槲皮素、楊梅素和蘆丁合成量較少（圖6）；對(duì)‘國(guó)育2016’與‘冀花4號(hào)’對(duì)比分析，‘國(guó)育2016’的山柰酚和蘆丁在黃酮和黃酮醇生物合成通路中代謝旺盛；將‘國(guó)育2016’與‘四粒紅’進(jìn)行對(duì)比分析，‘國(guó)育2016’的槲皮素和楊梅素在黃酮和黃酮醇生物合成通路中代謝旺盛。由此可知，顏色較深的花生紅衣（‘四粒紅’和‘國(guó)育2016’）中的山柰酚代謝旺盛，顏色較淺的花生紅衣（‘冀花4號(hào)’）中楊梅素和槲皮素代謝旺盛，合成量較多。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)利用代謝組學(xué)分析3 種不同顏色花生紅衣中（顏色由淺到深依次是‘冀花4號(hào)’、‘四粒紅’和‘國(guó)育2016’）的差異代謝產(chǎn)物并富集代謝通路，以期為花生紅衣的綜合利用及種源選擇提供科學(xué)參考。結(jié)果表明不同顏色的花生紅衣存在較大的代謝差異，依據(jù)>OPLS-DA模型的VIP值共篩選出16 種差異代謝物，顏色較深的花生紅衣（‘四粒紅’和‘國(guó)育2016’）山柰酚和表兒茶素-(4α→8)-沒食子兒茶素-(4α→8)-兒茶素含量明顯較多，且隨著紅衣顏色的加深，原花青素、楊梅素和槲皮素含量明顯升高。富集差異代謝物的差異顯著代謝通路共4 條，其中最顯著的為黃酮和黃酮醇生物合成途徑，山柰酚、槲皮素、楊梅素和蘆丁4 種差異代謝物參與此通路，山柰酚在顏色較深的花生紅衣中代謝旺盛，而楊梅素和槲皮素則在顏色較淺的花生紅衣中代謝旺盛，合成量較多。