何曾安，柳藝石，張慧杰，高曉冬，藤田盛久

（江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

生物藥物（biopharmaceuticals）是一類在生物體或生物組織中綜合利用生物化學(xué)、生物技術(shù)、微生物學(xué)、化學(xué)和藥學(xué)等多學(xué)科原理和方法制造出的，用于預(yù)防、治療或診斷的藥物。與傳統(tǒng)的小分子藥物相比，以單克隆抗體為代表的生物藥物具有較高的親和性和特異性，可高效識(shí)別靶點(diǎn)分子，且副作用極低。重組治療性蛋白質(zhì)正日益成為重要的醫(yī)療藥劑，用以治療癌癥及自身免疫性疾病等頑固性病癥[1]。截止2010年，包括生物抗體藥物在內(nèi)的重組蛋白質(zhì)已獲得了1 000億美元的市場(chǎng)銷售額[2]。

免疫球蛋白G（IgG）是重要的重組治療性生物藥物，目前已被廣泛地應(yīng)用于多種疾病的治療和診斷，如傳染病、免疫缺陷病及自身免疫性疾病等[3-4]。IgG由2條γ重鏈和2條輕鏈通過(guò)二硫鍵共價(jià)連接形成四聚體蛋白質(zhì)，每個(gè)輕鏈和重鏈的N端均含有針對(duì)同一抗原的抗原結(jié)合域。在IgG的Fc結(jié)構(gòu)域上有一個(gè)高度保守的N-糖基化位點(diǎn)[5]。目前生物抗體藥物主要由經(jīng)過(guò)基因工程改造可大規(guī)模培養(yǎng)的宿主細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)，這些工程細(xì)胞株主要有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）、幼年敘利亞地鼠腎細(xì)胞 （Baby Hamster Syrian Kidney、BHK），小鼠骨髓瘤細(xì)胞株 Sp2/0和 NSO等[6]。

如何在盡可能降低生產(chǎn)成本、提高產(chǎn)量的同時(shí)仍保持工藝的穩(wěn)定性和產(chǎn)品的一致性，依舊是抗體工業(yè)生產(chǎn)研發(fā)的方向。目前雖已有研究通過(guò)改善培養(yǎng)技術(shù)和優(yōu)化基因擴(kuò)增系統(tǒng)顯著提高了CHO細(xì)胞中抗體的產(chǎn)量[7-8]，但工業(yè)生產(chǎn)中所用的CHO細(xì)胞株的抗體表達(dá)水平仍遠(yuǎn)低于人體自身漿細(xì)胞。因此，在優(yōu)化產(chǎn)品、提升產(chǎn)量方面，哺乳動(dòng)物細(xì)胞株仍有較大改造潛力，其中針對(duì)分泌途徑進(jìn)行基因工程改造以提高抗體分泌量的需求尤為迫切。

為了克服哺乳動(dòng)物細(xì)胞株生產(chǎn)中產(chǎn)量較低的現(xiàn)狀，充分理解目的蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌途徑中所須的相關(guān)因子就顯得尤為重要。本研究中，作者采用HEK 293細(xì)胞即人體胚胎腎細(xì)胞構(gòu)建了一個(gè)可檢測(cè)抗體轉(zhuǎn)運(yùn)分泌的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。HEK 293細(xì)胞是由人腎胚細(xì)胞改造而成的永生化細(xì)胞株[9]，由于其具有較高的生長(zhǎng)速率和較好的蛋白質(zhì)分泌活性，已被廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)[10]。本研究中采用人源抗雞蛋清溶菌酶抗體 （anti-Hen egg white lysozyme antibody，HyHEL10） 作 為 模 式 抗 體 。HyHEL10是一種晶體結(jié)構(gòu)已知的單克隆抗體，以雞蛋清溶菌酶（hen egg white lysozyme，HEL）為抗原，且與抗原的識(shí)別機(jī)制也已十分清楚[11-12]。為了便于監(jiān)測(cè)抗體在細(xì)胞內(nèi)部的累積以及向胞外分泌的情況，本研究中構(gòu)建的重組型抗體在重鏈N端融合有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白單體 （monomeric enhanced green fluorescent protein，mEGFP）和 FLAG 標(biāo)簽，分別用蛋白質(zhì)合成抑制劑和蛋白質(zhì)運(yùn)輸抑制劑處理細(xì)胞后，細(xì)胞中代表抗體水平的EGFP綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生改變。本研究所構(gòu)建的抗體表達(dá)系統(tǒng)可用于抗體分泌及折疊相關(guān)因子的篩選。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人體胚胎腎細(xì)胞HEK 293和HEK 293T細(xì)胞株：均使用含有10%胎牛血清（FCS）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco，Life technologies，USA）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。

1.2 重組型抗體表達(dá)載體的構(gòu)建

以pME18s-HyHEL10-human-sIgG為模板，用上游引物CCCAAGCTTGAGGTGCAGCTTCAGGAG TCA和下游引物AAAAGCGGCCGCTCATTTACCCG GAGACAGGG（下劃線處分別為HindIII和NotI酶切位點(diǎn)）PCR擴(kuò)增抗體重鏈（HyHEL10-sIgG1）。以限制性內(nèi)切酶處理并純化PCR擴(kuò)增片段，用連接酶（Ligation Mix，Takara，JP）連接入載體 pMENeo2dH-mEGFP-FCD59_CD59ss[13]的HindIII和NotI位點(diǎn)，構(gòu)建出pME-NeodH-ssEGFP-FHyHEL10中間質(zhì)粒。

在pME-NeodH-ssEGFP-F-HyHEL10質(zhì)粒上用EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶切出抗體的重鏈可變區(qū)（VH），同時(shí)用NotI和XhoI限制性內(nèi)切酶切出抗體的重鏈恒定區(qū)（CH）。之后用連接酶（Ligation Mix，Takara，JP）將兩個(gè)片段同時(shí)連接入 pLIB2-pgkHyg逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的NotI和EcoRI酶切位點(diǎn)，從而構(gòu)建出pLIB2-pgkHyg-ssEGFP-FHyHEL10-sIgG1抗體重鏈表達(dá)載體。此載體可表達(dá)含有由人源hCD59信號(hào)肽引導(dǎo)的綠色熒光蛋白（EGFP），以及 FLAG 標(biāo)簽。

以pME18s-HyHEL10-human-kappa為模板，用上游引物AAAAGAATTCATGGATCCCAAAGGAT CCC和下游引物AAAAGCGGCCGCTAACACTCTC CCC（下劃線分別為EcoRI和NotI酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增抗體的輕鏈（HyHEL10-human-kappa），并將純化后的PCR擴(kuò)增片段連接入pLIB2-pgkBSD逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的NotI和EcoRI酶切位點(diǎn)，由此構(gòu)建出pLIB2-pgkBSD-HyHEL10-human-kappa抗體輕鏈表達(dá)載體。

1.3 HEK 293細(xì)胞株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

在6孔板上接種HEK 293T細(xì)胞，按照Lipofectamine2000 （Invitrogen，USA） 的說(shuō)明書，將pGP、pVSV-G與重組質(zhì)粒pLIB2-pgkHyg-ssEGFPF-HyHEL10-sIgG1或pLIB2-pgkBSD-HyHEL10-human-kappa 按照 1∶1∶2（m∶m∶m）轉(zhuǎn)染到 HEK 293T細(xì)胞，用以表達(dá)分別含有重組抗體重鏈（ssEGFP-FHyHEL10-sIgG1）或抗體輕鏈 （HyHEL10-humankappa）的逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒表達(dá)24 h后，將含有表達(dá)輕鏈病毒的培養(yǎng)基上清液與重鏈病毒培養(yǎng)基上清液以 1∶1（V∶V）混合，轉(zhuǎn)染入 6 孔板中的 HEK 293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)預(yù)先加入1 000×溴化己二甲銨（SIGMA，USA）以增加病毒轉(zhuǎn)染效率。病毒轉(zhuǎn)染24 h后用殺稻瘟菌素（blasticidin，InvivoGen，USA）和潮霉素（hygromycin，InvivoGen，USA）共同篩選 1 w。 用流式細(xì)胞分選儀S3e（Bio-Rad，USA）分選富集具有中等抗體表達(dá)量的陽(yáng)性細(xì)胞，并用有限稀釋法（limiting dilution cloning，LDC）分離單克隆細(xì)胞株，由此獲得HEK 293 E-F-HyHEL10穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。

1.4 流式細(xì)胞分析

用胰酶（Sangon，CN）消化處理并收集細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，Sangon，CN）洗滌并重懸 （細(xì)胞終濃度為5×105個(gè)/mL）。采用 BD Accuri C6（BD，USA）流式細(xì)胞分析儀分析代表重組抗體水平的EGFP綠色熒光蛋白信號(hào)。

1.5 蛋白質(zhì)印記法

將細(xì)胞接種于6孔板，以無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)基上清液，同時(shí)收集并裂解細(xì)胞提取胞內(nèi)蛋白質(zhì)。分別用還原態(tài)和非還原態(tài)的4×上樣緩沖液稀釋并煮沸樣品。用10%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜和封閉結(jié)束后，依次使用5%脫脂牛奶稀釋8 000倍的一抗 （AffiniPure Rabbit Anti-Human IgG（H+L），Jackson，USA）和二抗（Goat Anti-Rabbit IgG（H+L），HRP-Conjugated，Transgen，CN）孵育PVDF膜。最后用ECL顯色試劑 （Bio-Rad，USA）顯色并觀察結(jié)果，從而檢測(cè) E-FHyHEL10抗體表達(dá)情況。

雞蛋清溶菌酶 （hen egg white lysozyme，HEL，SIGMA，USA）用5×上樣緩沖液稀釋，95℃煮沸 5 min，在15 g/dL SDS-PAGE中進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳。將HEK 293 E-F-HyHEL10細(xì)胞接種于6 cm板，用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集培養(yǎng)基上清液5 mL，作為一抗加入轉(zhuǎn)有HEL作為抗原的PVDF膜室溫孵育。并使用5%脫脂牛奶稀釋8 000倍的二抗（Peroxidase AffniPure Goat Anti-Human IgG（H+L），Jackson，USA）室溫孵育。最后以ECL顯色試劑（Bio-Rad，USA）顯色并觀察結(jié)果，用以檢測(cè)E-FHyHEL10抗體功能。

1.6 重組型抗體的純化

在10塊15 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)HEK 293 E-FHyHEL10細(xì)胞，用含10%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液，再用含1%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h并收集培養(yǎng)液。 用 anti-DDDDK-tag Gel（MBL，JP）沉淀培養(yǎng)基中的E-F-HyHEL10重組抗體，之后用洗脫蛋白質(zhì) （DDDDK-tagged Protein，MBL，JP）洗脫。收集洗脫液并加入透析盒 （Slide-A-LyzerTMG2 Dialysis Cassettes，20K MWCO、3 mL，Thermo Scientific，USA）以去除多余的洗脫蛋白質(zhì)。用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒 （Beyotime Biotechnology，CN）測(cè)定純化獲得的E-F-HyHEL10抗體標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量濃度。

1.7 銀染

將純化的E-F-HyHEL10標(biāo)準(zhǔn)樣品用10 g/dL SDS-PAGE進(jìn)行蛋白質(zhì)凝膠電泳，使用快速銀染試劑盒（Beyotime Biotechnology，CN）顯色，并分析顯色結(jié)果。

1.8 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）

用雞蛋清溶菌酶 （HEL，SIGMA，USA）作為抗原，在 96 孔免疫板（Thermo Scientific Nunc，USA）中鋪板。封閉液（PBS，10%FCS）室溫封閉后，加入一抗孵育。一抗實(shí)驗(yàn)組采用HEK 293 E-F-HyHEL10細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基上清液。一抗對(duì)照組用純化的E-F-HyHEL10標(biāo)準(zhǔn)品并稀釋至12個(gè)質(zhì)量濃度梯度 ：0、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000 ng/mL。之后加入封閉液稀釋2 000倍的二抗 （Peroxidase AffniPure Goat Anti-Human IgG（H+L），Jackson，USA） 孵育。 最后以 1×TMB 溶液（eBioscience，USA） 顯色， 并用終止液 （1 mol/L H2SO4）結(jié)束顯色。 用酶標(biāo)儀（Bio-Rad，USA）在 450 nm下檢測(cè)樣品吸光度。按照對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此曲線函數(shù)計(jì)算出其它實(shí)驗(yàn)組樣品的抗體質(zhì)量濃度。

1.9 蛋白質(zhì)合成抑制劑與分泌抑制劑的處理

在12孔板中接種HEK 293 E-F-HyHEL10細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后更換為含有蛋白質(zhì)合成抑制劑或運(yùn)輸抑制劑的無(wú)血清培養(yǎng)基處理細(xì)胞。蛋白質(zhì)分泌抑制劑選用1.25 μg/mL布雷菲德菌素A（brefeldin A，BioLegend，USA）[14]，蛋白質(zhì)合成抑制劑選用 100 μg/mL放線菌酮（cycloheximide，Cell Signaling Technology，USA）[15]，分別處理不同時(shí)間。藥物處理結(jié)束后收集細(xì)胞，用 BD Accuri C6（BD，USA）流式細(xì)胞分析儀分析胞內(nèi)抗體累積量。以BFA處理為例，對(duì)抗體胞內(nèi)累積水平進(jìn)行量化分析，用如下公式計(jì)算：

公式中采用相應(yīng)樣品的EGFP綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度值進(jìn)行計(jì)算，定義HEK 293細(xì)胞樣品的信號(hào)值為“親本細(xì)胞組”，未經(jīng)BFA處理的HEK 293 E-FHyHEL10細(xì)胞樣品信號(hào)值被定義為“BFA對(duì)照組”。依照抗體累積倍數(shù)與處理時(shí)間關(guān)系作圖，同時(shí)取培養(yǎng)基上清液進(jìn)行ELISA，分析胞外抗體分泌量。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組型抗體表達(dá)載體的驗(yàn)證

為了構(gòu)建一個(gè)可用于監(jiān)測(cè)抗體分泌和累積情況的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，作者首先設(shè)計(jì)構(gòu)建了2個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體（圖1（a）），共同表達(dá)重組型抗體EGFP-FLAG-HyHEL10。選取的模式抗體HyHEL10，即抗蛋清溶菌酶抗體（anti-Hen egg white lysozyme antibody），是一種表征良好的抗體，具有人源IgG1亞型。其中重組抗體重鏈的N端融合有一個(gè)人源CD59的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽（hCD59ss），一個(gè)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白單體 （mEGFP），以及一個(gè)FLAG標(biāo)簽（圖1（b））。在分泌運(yùn)輸過(guò)程中，抗體的C端通常參與識(shí)別運(yùn)載受體。因此，為保持C端恒定域的原有功能，作者將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)肽引導(dǎo)的mEGFP和FLAG標(biāo)簽均融合在抗體重鏈的N端。共同轉(zhuǎn)染表達(dá)HyHEL10輕鏈和重鏈的載體時(shí)，細(xì)胞可表達(dá)成熟的分泌型抗體。

核酸凝膠電泳結(jié)果顯示，雙酶切驗(yàn)證重組抗體表達(dá)載體pLIB2-pgkHyg-ssEGFP-F-HyHEL10-sIgG1和pLIB2-pgkBSD-HyHEL10-human-kappa均得到兩個(gè)片段，其中重組抗體重鏈 （ssEGFP-FHyHEL10-sIgG1）大小為 2 094 bp，抗體輕鏈（HyHEL10-human-kappa）為 723 bp（圖 1（c）），且測(cè)序結(jié)果與模板序列完全匹配。

圖1 重組型抗體表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of vectors for recombinant immunoglobulin expression

2.2 HEK 293 E-F-HyHEL10穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建

用HEK 293T細(xì)胞分別表達(dá)的含有抗體重鏈和輕鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞，從而構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)EGFP-FLAG-HyHEL10的HEK 293細(xì)胞株。用流式細(xì)胞術(shù)分析每株單克隆細(xì)胞株的抗體表達(dá)量，依據(jù)EGFP熒光信號(hào)的強(qiáng)度，最終選取具有中等抗體表達(dá)水平的4號(hào)細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn) （圖2（a））。核酸凝膠電泳結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增4號(hào)細(xì)胞株基因組可得到正確大小的抗體重鏈和輕鏈DNA片段（圖2（b）），證明抗體重鏈和輕鏈的表達(dá)基因已正確整合入受體細(xì)胞基因組。

作者進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)印記法驗(yàn)證HEK 293 E-F-HyHEL10 No.4細(xì)胞株的胞內(nèi)裂解樣品及培養(yǎng)基上清液樣品中抗體的表達(dá)情況。由于還原條件下抗體重鏈、輕鏈間的二硫鍵被打斷，Western印記分析結(jié)果可以檢測(cè)到還原態(tài)下約75 000的重組抗體重鏈（ssEGFP-F-HyHEL10-sIgG1），以及約 27 000的抗體輕鏈（HyHEL10-human-kappa）。同時(shí)也可檢測(cè)到非還原態(tài)下200 000左右的重組抗體全長(zhǎng) （圖2（c））。蛋白質(zhì)印跡法在胞內(nèi)裂解樣品及培養(yǎng)基上清液樣品中均可檢測(cè)到正確大小的重組抗體，說(shuō)明HEK 293 E-F-HyHEL10 No.4細(xì)胞株可以正確表達(dá)并分泌重組抗體。此外，作者推測(cè)細(xì)胞裂解樣品中被檢測(cè)出的其他條帶應(yīng)該是未完全折疊且滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中的抗體重鏈，只有正確折疊聚合的抗體才可被分泌至培養(yǎng)基中。

圖2 構(gòu)建HEK 293 E-F-HyHEL10穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株Fig.2 Establishment of HEK 293 cells expressing an EGFP-fused antibody

2.3 EGFP融合型抗體功能的檢測(cè)

由于表達(dá)的重組型抗體重鏈的N端融合有EGFP綠色熒光蛋白和FLAG標(biāo)簽，且成熟的抗體N端是識(shí)別相應(yīng)抗原的抗原結(jié)合域，故對(duì)表達(dá)的重組型抗體是否能夠依舊維持其生物功能進(jìn)行了確認(rèn)。實(shí)驗(yàn)中使用雞蛋清溶菌酶 （HEL）作為E-FHyHEL10重組抗體的抗原。蛋白質(zhì)印記結(jié)果顯示出14 000的 HEL（圖 3（a）），說(shuō)明重組型抗體可以識(shí)別相應(yīng)的抗原，抗體N端融合的兩個(gè)標(biāo)簽并不影響抗體功能的發(fā)揮。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組型抗體的功能性，作者從低血清培養(yǎng)基上清液中純化出E-F-HyHEL10標(biāo)準(zhǔn)樣品（圖3（b））。用純化后稀釋至不同濃度的E-FHyHEL10孵育經(jīng)HEL鋪板的免疫96孔板，并進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，依據(jù)樣品顯色后的吸光度值與抗體加樣量擬合繪制曲線。ELISA結(jié)果顯示，隨著抗體加樣濃度的提高樣品吸光度值也相應(yīng)提高，由此表明E-F-HyHEL10與HEL的結(jié)合量與抗體本身的加樣量有關(guān)（圖3（c））。此結(jié)果進(jìn)一步證明EGFP融合型抗體仍具有良好的功能活性。

圖3 重組型抗體的功能驗(yàn)證Fig.3 EGFP-fused antibody is functional

2.4 蛋白質(zhì)分泌運(yùn)輸抑制劑對(duì)重組抗體表達(dá)和分泌的影響

布雷菲德菌素A（BFA）可通過(guò)抑制外殼蛋白復(fù)合體 I（coat protein complex I，COPI）的形成間接抑制蛋白質(zhì)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）到高爾基體的分泌運(yùn)輸[16]。為了監(jiān)測(cè)抗體的分泌情況，作者使用布雷菲德菌素A作為蛋白質(zhì)分泌運(yùn)輸抑制劑，依照1.9中的試驗(yàn)方法處理HEK 293 E-FHyHEL10細(xì)胞。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，BFA處理后胞內(nèi)抗體累積量有明顯提升（圖4（a））。進(jìn)一步對(duì)抗體胞內(nèi)累積水平進(jìn)行量化分析，如圖4（b）所示，BFA處理36 h后抗體的胞內(nèi)累積量達(dá)到最大值，是對(duì)照組的1.6倍。取培養(yǎng)基上清液進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定重組抗體的胞外分泌量，結(jié)果顯示BFA作為有效的蛋白質(zhì)分泌抑制劑對(duì)抗體分泌至胞外有顯著的抑制作用，因?yàn)閹缀鯚o(wú)法在培養(yǎng)液上清樣品中檢測(cè)到分泌的重組抗體（圖4（c））。此結(jié)果與流式細(xì)胞分析結(jié)果相吻合。

圖4 布雷菲德菌素A（BFA）對(duì)抗體表達(dá)細(xì)胞株的處理Fig.4 Treatment of brefeldin A （BFA）on HEK 293 EF-HyHEL10 cells

2.5 蛋白質(zhì)合成抑制劑對(duì)重組抗體表達(dá)和分泌的影響

使用放線菌酮 （CHX）處理HEK 293 E-FHyHEL10細(xì)胞，流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，CHX處理后的細(xì)胞中抗體累積量明顯降低（圖5（a））。使用1.9中的定量計(jì)算公式同樣對(duì)CHX處理樣品進(jìn)行量化分析，在CHX處理12 h后抗體的胞內(nèi)累積量急劇下降至對(duì)照組的0.7倍，并在后續(xù)處理的35 h內(nèi)逐漸維持在0.5倍的水平（圖5（b））。ELISA結(jié)果顯示，無(wú)法在CHX處理的培養(yǎng)液上清液樣品中檢測(cè)到分泌的重組抗體（圖5（c））。這兩個(gè)結(jié)果共同證明，放線菌酮作為蛋白合成抑制劑抑制了抗體的合成，使得抗體無(wú)法在胞內(nèi)合成并累積，更無(wú)重組抗體分泌到胞外。

圖5 放線菌酮（CHX）對(duì)抗體表達(dá)細(xì)胞株的處理Fig.5 Treatment of cycloheximide （CHX）on HEK 293 E-F-HyHEL10 cells

3 結(jié) 語(yǔ)

截至目前，與細(xì)胞株基因工程改造的相關(guān)研究主要關(guān)注在以下方面：通過(guò)改造啟動(dòng)子或引入基因擴(kuò)增系統(tǒng)以提高基因轉(zhuǎn)錄水平；通過(guò)優(yōu)化表達(dá)原件以改善蛋白質(zhì)翻譯水平從而提高產(chǎn)量等[17-18]。盡管針對(duì)蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸?shù)幕蚬こ谈脑焓莾?yōu)化的主要內(nèi)容，但相應(yīng)的機(jī)理研究工作仍是各項(xiàng)工業(yè)優(yōu)化的基礎(chǔ)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，抗體首先在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，經(jīng)過(guò)正確的蛋白質(zhì)糖基化和折疊后被運(yùn)送到高爾基體?？贵w上的糖鏈會(huì)在高爾基體中被進(jìn)一步修飾改造，并被分揀入反式高爾基網(wǎng)而最終分泌至培養(yǎng)基中。針對(duì)這一抗體分泌運(yùn)輸途徑開展研究的最大阻礙是缺乏可以靈活檢測(cè)抗體分泌運(yùn)輸?shù)谋磉_(dá)細(xì)胞株。

作者構(gòu)建了可穩(wěn)定表達(dá)E-F-HyHEL10重組型抗體的HEK 293細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，這一表達(dá)系統(tǒng)可被成功地用于靈活檢測(cè)抗體表達(dá)及分泌水平。該系統(tǒng)具有良好的抗體表達(dá)量及分泌量，同時(shí)穩(wěn)定維持了抗體的功能活性。研究結(jié)果表明，布雷菲德菌素A和放線菌酮處理細(xì)胞，對(duì)抗體的胞內(nèi)累積和胞外分泌途徑均有積極影響，說(shuō)明本抗體表達(dá)系統(tǒng)可靈敏地響應(yīng)蛋白質(zhì)分泌抑制劑和蛋白質(zhì)合成抑制劑的擾動(dòng)，進(jìn)而證明本研究中構(gòu)建的抗體表達(dá)系統(tǒng)具有靈活表征胞內(nèi)胞外抗體分泌及表達(dá)情況的特性，可實(shí)現(xiàn)抗體表達(dá)、累積和分泌水平的準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)。

本研究構(gòu)建的可監(jiān)測(cè)抗體分泌的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，未來(lái)可用于篩選鑒定與抗體分泌相關(guān)的因子。比如通過(guò)用化學(xué)藥物對(duì)細(xì)胞的處理鑒定出可作用于抗體分泌的化學(xué)藥物。新一代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9，是現(xiàn)今十分高效的基因編輯工具[19]，已有研究運(yùn)用CRISPR/Cas9基因敲除文庫(kù)進(jìn)行基因組篩選[20]。本研究構(gòu)建的重組抗體監(jiān)控系統(tǒng)中亦可引入CRISPR/Cas9基因敲除文庫(kù)，用于篩選與抗體折疊、分泌相關(guān)的基因。此外，可將研究中構(gòu)建的逆轉(zhuǎn)錄病毒重組表達(dá)載體系統(tǒng)引入HAP1人源單倍體細(xì)胞株[21]，構(gòu)建重組抗體單倍體細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，并利用HAP1細(xì)胞的單倍體基因組優(yōu)勢(shì)進(jìn)行正向遺傳學(xué)篩選。作者已先期構(gòu)建了用于篩選抗體分泌相關(guān)因子的HAP1 E-F-HyHEL10穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株 （未發(fā)表）。用這一可監(jiān)控細(xì)胞株篩選獲得關(guān)鍵性因子后，未來(lái)可將這些因子應(yīng)用于改造重組型抗體表達(dá)細(xì)胞株以提高生物藥品的產(chǎn)量。