王群 袁杰 黃軍 湯繼英 汪選斌 梅虹

1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院普外3 科（湖北十堰442000）；湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院2腫瘤科，3甲狀腺乳腺外科（湖北十堰442000）

甲狀腺癌一種常見的頭頸部和內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，甲狀腺癌發(fā)病機制不明確且起病隱匿，導(dǎo)致早期診斷較為困難［1-2］。深入了解甲狀腺癌發(fā)生的分子機制及診斷標志物，是甲狀腺癌臨床研究的瓶頸。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）是一類由超過200 個核苷酸組成的非編碼RNA，通過調(diào)控下游分子表達，在乳腺癌、甲狀腺癌等很多腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用［3-5］。LINC00377 是一種新確定的LncRNA。本研究通過檢測LINC00377 在甲狀腺癌組織和細胞株中的表達情況，分析LINC00377與甲狀腺癌發(fā)生的相關(guān)性，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達甲狀腺癌細胞中的LINC00377，分析過表達LINC00377 抑制甲狀腺癌細胞增殖、遷移的分子機制，為甲狀腺癌發(fā)生機制研究及尋找診斷標志物提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 臨床標本收集2016年8月至2018年4月湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院腫瘤中心35 例甲狀腺癌手術(shù)切除標本。男6 例、女29 例，年齡21～58 歲，平均（37.46 ± 4.19）歲。本研究獲得本院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。甲狀腺乳頭狀癌32 例，甲狀腺濾泡癌3 例。臨床分期：Ⅰ期16 例、Ⅱ期12 例、Ⅲ期7 例。所有患者術(shù)前均未行放化療。每例標本均取得癌組織和相應(yīng)的癌旁組織，由本院病理科專家進行病理學(xué)確認。手術(shù)標本于液氮中冷凍保存。

1.2 細胞與主要試劑RPMI 1640 培養(yǎng)基、DMEM∕F12 培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco 公司。甲狀腺癌細胞MDA-T32、B-CPAP、TT、TPC-1、SW579 和正常甲狀腺濾泡上皮細胞Nthy-ori3-1購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。引物（LINC00377、GAPDH、U6、miR-29a-3p和ADAMTS9）購自上海生物工程股份有限公司。Lipofectamine 3000 購自 美 國Invitrogen 公司。Transwell 小室購自美國Corning 公司。qRT-PCR 相關(guān)試劑盒購自日本TaKaRa 公司。CCK-8 試劑盒購自美國Sigma 公司陰性對照質(zhì)粒及LINC00377 表達載體購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。一抗ADAMTS9、α-Tubulin、AKT、p-AKT、p65、MMP2及二抗均購自美國CST 公司。

1.3 RNA 提取和實時熒光定量PCR（qRTPCR）35 例樣本和細胞使用TRIzol 氯仿提取法提取，qRT-PCR 檢測按照TaKaRa 試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，擴增條件設(shè)定為94 ℃預(yù)變性10 min；60 ℃25 s，72 ℃25 s，40 個循環(huán)。反應(yīng)體系為20 μL。LINC00377 上游引物為5′-AGGCACGTCTTACATGACCA-3′，下 游 引 物 為5′-CCCTAGTGCTGTTCTTCTGACA-3′；GAPDH上游引物為5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；ADAMTS9上游引物為5′-ATTAGAGACCCTGAGCGAATACG-3′，下游引物為5′-GAAGTGGACGTTCGTGGGAA-3′；miR-29a-3p上游引物為5′-GGGTAGCACCATCTGAAAT -3′，下游引物為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；U6上游引物為5--CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用2-ΔΔCt方法計算，以GAPDH為內(nèi)參檢測LINC00377 和ADAMTS9mRNA 的表達，以U6為內(nèi)參檢測miR-29a-3p 的表達。

1.4 細胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW579、TT 和TPC-1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM∕F12 培養(yǎng)基中，MDA-T32、B-CPAP 和Nthy-ori3-1 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的SW579 細胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染操作根據(jù)LipofectamineTM3000 說明書進行，轉(zhuǎn)染LINC00377 表達質(zhì)粒作為實驗組，以攜帶無意義序列的陰性對照質(zhì)粒作為對照組。常規(guī)培養(yǎng)12 h 后，更換新鮮培養(yǎng)基。

1.5 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測LINC00377 的下游分子機制采用LncBase Predicted v.2 軟件預(yù)測LINC00377 下游互補結(jié)合的miRNA，采用TargetScan Release 3.1 軟件預(yù)測下游miRNA 互補結(jié)合的下游基因。

1.6 Western Blot 實驗檢測ADAMTS9 蛋白的表達水平裂解細胞并提取總蛋白，制備蛋白樣品30 μg，灌制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠并上樣恒壓100 V 電泳，聚偏氟乙烯膜恒流200 mA轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉70 min，一抗：ADAMTS9（1∶2 000 稀釋）、CDK4（1∶500 稀釋）、Cyclin D1（1∶1 000 稀釋）、MMP-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶5 000）、N-cadherin（1∶5 000）及α-Tubulin（1∶1 000），4 ℃下孵育過夜。二抗室溫孵育70 min，迅速以ECL 顯影液顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.7 CCK-8 檢測轉(zhuǎn)染后SW579 細胞增殖取對照組和實驗組對數(shù)生長期的SW579 細胞制成細胞懸液，每組設(shè)4 個復(fù)孔，以每孔3×103個細胞鋪于96孔板，每孔200 μL，每2 d換液。每24 h以CCK-8法進行檢測，每孔加15 μL CCK-8 溶液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標儀測定在450 nm 波長處每組細胞的吸光度（OD）值，連續(xù)監(jiān)測5 次。

1.8 Transwell 實驗檢測轉(zhuǎn)染后SW579 細胞遷移取對照組和實驗組對數(shù)生長期的SW579 細胞用無血清DMEM∕F12 培養(yǎng)基制成細胞懸液，每組設(shè)4 個復(fù)孔，以每室4 × 104個細胞鋪于Transwell上室，每室200 μL。Transwell 下室加600 μL 含10%胎牛血清的DMEM∕F12 培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。1 mL 4%多聚甲醛固定15 min，1 mL 0.1%結(jié)晶紫染色15 min。流水輕輕沖洗，棉簽擦去未穿過孔膜的SW579 細胞。在倒置顯微鏡高倍鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)，多個視野下取均值，統(tǒng)計分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差表示，定量資料采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00377 在甲狀腺癌組織和細胞株中低表達qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，LINC00377 在35 例甲狀腺癌組織中的表達量相較癌旁組織明顯下降（1.24 ± 0.54vs.7.27 ± 1.13，P＜0.01，圖1）；LINC00377 在甲狀腺癌細胞株中的表達量相較正常甲狀腺濾泡上皮細胞明顯下降（P＜0.01，圖2），其中在SW579 細胞中下降的最明顯。

圖1 LINC00377 在甲狀腺癌組織和癌旁組織中的表達水平Fig.1 Expression level of LINC00377 in thyroid cancer and adjacent tissues

圖2 LINC00377 在甲狀腺癌細胞株和正常甲狀腺濾泡上皮細胞中的表達水平Fig.2 Expression level of LINC00377 in thyroid cancer cell lines and normal thyroid follicular epithelial cell

2.2 轉(zhuǎn)染LINC00377 表達質(zhì)粒促進SW579 細胞中LINC00377 表達轉(zhuǎn)染LINC00377 表達質(zhì)粒后，qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，實驗組SW579 細胞中LINC00377 表達量相較對照組明顯增加（1.07 ±0.22vs.15.96±0.65，P＜0.01）。

2.3 生物信息學(xué)軟件預(yù)測LINC00377 下游分子機制LncBase Predicted v.2 軟件預(yù)測顯示，LINC00377 可互補結(jié)合miR-29a-3p；TargetScan Release 3.1 軟件預(yù)測顯示，miR-29a-3p 可互補結(jié)合ADAMTS9mRNA。見圖3。

圖3 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測LINC00377 下游分子機制Fig.3 Bioinformatics technology predicts downstream molecular mechanism of LINC00377

2.4 過表達LINC00377 對SW579 細胞中miR-29a-3p 和ADAMTS9mRNA 表達水平的影響qRTPCR 檢測結(jié)果顯示，實驗組SW579 細胞中miR-29a-3p mRNA 表達水平明顯高于對照組（1.00 ± 0.03vs.0.12 ± 0.02，P＜0.01），ADAMTS9mRNA 表達水平明顯低于對照組（1.00 ± 0.04vs.8.59 ± 0.27，P＜0.01），表明過表達LINC00377 可下調(diào)miR-29a-3p mRNA 的表達，上調(diào)ADAMTS9mRNA 的表達。

2.5 過表達LINC00377 對ADAMTS9 蛋白表達的影響Western Blot 檢測結(jié)果（圖4）顯示，過表達LINC00377 后，ADAMTS9 蛋白表達水平升高，細胞EGFR∕AKT∕NFκB 通路蛋白p-AKT、p65、MMP2表達下調(diào)，AKT 蛋白表達無明顯差異，表明EGFR∕AKT∕NFκB 通路被抑制。

2.6 過表達LINC00377 抑制SW579 細胞的增殖CCK-8 法結(jié)果（圖5）顯示，在第3、4、5 天，過表達LINC00377 的實驗組SW579 細胞OD值明顯低于對照組（P＜0.05），表明過表達LINC00377 可抑制SW579 細胞的增殖能力。

圖4 過表達LINC00377 對SW579 細胞ADAMTS9 和EGFR∕AKT∕NFκB 通路蛋白表達的影響Fig.4 Effect of high-expressed LINC00377 on the expression of ADAMTS9 protein and EGFR∕AKT∕NFκB proteins in SW579 cells

圖5 過表達LINC00377 對SW579 細胞增殖能力的影響Fig.5 Effect of overexpression LINC00377 on the proliferation of SW579 cells

2.7 過表達LINC00377 明顯抑制SW579 細胞的遷移Transwell 遷移實驗結(jié)果（圖6）顯示，實驗組SW579 細胞穿過底膜的細胞數(shù)明顯少于對照組［（64.10±11.33）vs.（180.30±24.43）個，P＜0.01］，表明過表達LINC00377 可抑制SW579 細胞的遷移能力。

圖6 過表達LINC00377 對SW579 細胞遷移能力的影響Fig.6 Effect of overexpression LINC00377 on the migration of SW579 cells

3 討論

LncRNA 是非編碼家族中的一員，在非編碼RNA 中數(shù)量最多，廣泛表達于人體細胞［6］。LncRNA 本身不具有編碼蛋白的能力，長期以來被認為不具有生物學(xué)功能，是“轉(zhuǎn)錄噪音”［7］。近年來大量的研究［8］發(fā)現(xiàn)，LncRNA 廣泛參與細胞的各種生物學(xué)行為如分化、增殖、衰老、遷移等，在基因轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮重要的調(diào)控作用。越來越多的LncRNA 如LINC00514、DGCR5、NEAT1、LINC00460 被發(fā)現(xiàn)在甲狀腺癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控細胞多種分子和信號通路，參與抑制或促進甲狀腺癌的進展［9-12］。然而，LncRNA 在甲狀腺癌中的研究仍處于初級階段。LINC00377是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，其在甲狀腺癌中的作用未見報道研究。

本研究通過qRT-PCR 檢測顯示，LINC00377 在甲狀腺癌組織中的表達量相較癌旁組織顯著下調(diào)，在甲狀腺癌中的表達水平相較正常甲狀腺濾泡上皮細胞顯著下調(diào)，表明LINC00377 的低表達可能與甲狀腺癌的發(fā)生有關(guān)。LncRNA 調(diào)控基因表達的重要機制之一是“海綿效應(yīng)”，即通過互補結(jié)合下游微?。╩iRNA），下調(diào)下游miRNA 的表達［13］。miRNA 可互補結(jié)合下游基因mRNA，具有抑制下游基因表達的作用［14］。LncRNA 通過下調(diào)下游miRNA 的表達，進而可上調(diào)miRNA 下游mRNA 的表達［15］。通過生物信息技術(shù)發(fā)現(xiàn)，LINC00377 可互補結(jié)合miR-29a-3p，miR-29a-3p 可互補結(jié)合含I 型血小板反應(yīng)蛋白模體的解聚素金屬蛋白酶9（ADAMTS9）。研究［16］表明，miR-29a-3p在胃癌組織中呈高表達，可促進胃癌細胞的增殖和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)揮原癌基因作用。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染LINC00377 表達質(zhì)粒可明顯下調(diào)甲狀腺癌細胞中miR-29a-3p 的表達。ADAMTS9基因位于人類染色體3p12-14 區(qū)域，是ADAMTS 家族成員之一，與細胞外基質(zhì)重塑、血管生成、炎癥等病理生理過程有關(guān)［17］。ADAMTS9已在肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌多種類型的惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)低表達，可通過干擾EGFR∕AKT∕NFκB 通路的激活，抑制腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，ADAMTS9被確定為抑癌基因［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染LINC00377質(zhì)粒能明顯下調(diào)甲狀腺癌細胞中miR-29a-3p 的表達，miR-29a-3p的低表達可明顯上調(diào)ADAMTS9基因的表達，提示LINC00377 可能是通過直接靶向負調(diào)控miR-29a-3p，間接正向調(diào)控ADAMTS9基因的表達的表達，抑制甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展。EGFR∕AKT∕NFκB信號通路與甲狀腺的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［19］。ADAMTS9基因表達上調(diào)后，EGFR∕AKT∕NFκB 通路蛋白的表達明顯降低，提示SW579 細胞增殖和遷移能力降低。本研究進一步通過CCK-8 法和Transwell 遷移實驗顯示，過表達LINC00377 可抑制甲狀腺癌細胞的增殖和遷移。

綜上，LINC00377 在甲狀腺癌組織和甲狀腺癌細胞株呈低表達。在SW579 細胞中，過表達LINC00377 可通過下調(diào)miR-29a-3p 的表達，上調(diào)ADAMTS9基因的表達，抑制甲狀腺癌SW579 細胞的增殖和遷移，為甲狀腺癌的診斷標志物研究和靶向治療提供了參考依據(jù)。