徐茂紅1,戴根來,周美云

(1.皖西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,安徽六安 237005;2.合肥久諾醫(yī)藥科技有限公司,安徽合肥 230088)

泊馬度胺(Pomalidomide),化學(xué)名為3-氨基-N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)鄰苯二甲酰亞胺,是美國(guó)Celgene公司研發(fā)的第三代免疫調(diào)節(jié)劑,于2013年2月首次在美國(guó)獲準(zhǔn)上市[1]。其具有抗多發(fā)性骨髓瘤腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵功能,適用于既往接受過至少兩種藥物(包括來那度胺、硼替佐米)且最近治療進(jìn)行中或治療完成60 d內(nèi)疾病進(jìn)展的多發(fā)性骨髓瘤患者[2]。泊馬度胺的生產(chǎn)工藝復(fù)雜,生產(chǎn)過程使用多種有機(jī)溶劑,如甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)等[3-6]。根據(jù)人用藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)要求,必須對(duì)殘留溶劑進(jìn)行檢測(cè),以保障用藥安全。經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研,關(guān)于泊馬度胺原料中殘留溶劑的測(cè)定方法雖有報(bào)道,但文獻(xiàn)中研究的殘留溶劑種類較少,且未包含本研究中的溶劑,各國(guó)藥典也均未收載。在泊馬度胺合成過程中使用的有機(jī)溶劑多達(dá)十余種,采用同一種方法檢測(cè)所有溶劑很難實(shí)現(xiàn)。本文在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用氣相色譜法一次性測(cè)定甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙酸5種溶劑殘留量,依據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)對(duì)原料藥中殘留溶劑測(cè)定的要求[7],進(jìn)行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證,以期為泊馬度胺的生產(chǎn)工藝改進(jìn)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泊馬度胺樣品(3批批號(hào)分別為130301、130302、130303) 合肥久諾醫(yī)藥科技有限公司;二甲基亞砜、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙酸 均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

HP1890氣相色譜儀 惠普上海分析儀器有限公司;METTLER AB135-S 十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent DB-624(30 m×0.53 mm×3.0 μm),FID 檢測(cè)器,以氮?dú)鉃檩d氣,流速4.0 mL·min-1,程序升溫,起始溫度為70 ℃,維持5 min,以每分鐘10 ℃的速率升溫至220 ℃,220 ℃維持10 min;進(jìn)樣口溫度為180 ℃;檢測(cè)器溫度為250 ℃,進(jìn)樣量1 μL。氮?dú)饬髁?30 mL·min-1,氫氣流量:30 mL·min-1,空氣流量:300 mL·min-1[8]。

1.2.2 溶液制備 單標(biāo)溶液的制備:取甲醇300 mg、乙醇500 mg、乙酸乙酯500 mg、二氧六環(huán)38 mg、乙酸500 mg,精密稱定,分別置于不同含有適量二甲基亞砜的100 mL量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至刻度,搖勻,作為單標(biāo)貯備液。精密量取單標(biāo)貯備液5 mL,置50 mL量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL約含甲醇300 μg、乙醇500 μg、乙酸乙酯500 μg、二氧六環(huán)38 μg、乙酸500 μg的溶液,作為單標(biāo)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備:取甲醇300 mg、乙醇500 mg、乙酸乙酯500 mg、二氧六環(huán)38 mg、乙酸500 mg,精密稱定,置于同一含有適量二甲基亞砜的100 mL量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至刻度,搖勻,作為混合對(duì)照品貯備液。精密量取混合對(duì)照品貯備液5 mL,置于50 mL量瓶中,加二甲基亞砜稀釋至刻度,搖勻,制成每1 mL約含甲醇300 μg、乙醇500 μg、乙酸乙酯500 μg、二氧六環(huán)38 μg、乙酸500 μg的混合溶液,作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:取泊馬度胺約1.0 g,精密稱定,置于10 mL量瓶中,加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察

分別取“1.2.2”項(xiàng)下單標(biāo)溶液、混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液與空白溶劑(二甲基亞砜),照“1.2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行檢測(cè),記錄色譜圖,確定各單標(biāo)保留時(shí)間,計(jì)算各組分峰的分離度(R,R=2(tR2-tR1)/(W1+W2))。2015版《中國(guó)藥典》(四部)規(guī)定,GC法檢測(cè)理論塔板數(shù)大于5000、分離度大于1.5滿足要求。結(jié)果顯示:空白溶劑及樣品無干擾,各組分峰理論塔板數(shù)和分離度均符合2015年版《中國(guó)藥典》要求,最小分離度R=4.000>1.5,各峰的理論塔板數(shù)分別為16919、13323、13901、16701、74032;各峰分離度分別為4.000、13.647、12.710、23.899?？瞻自噭⒐┰嚻啡芤?、混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的GC圖譜見圖1,保留時(shí)間及分離度結(jié)果見表1。

圖1 空白溶劑(A)、供試品溶液(B)和混合溶液(C)的GC圖譜Fig.1 GC chromatograms of blank solution(A),pomalidomide bulks drug(B)and mixed solution(C)

表1 專屬性測(cè)定結(jié)果Table 1 The results of specificity test

表2 殘留溶劑定量限、檢測(cè)限及線性方程研究結(jié)果Table 2 The limits of quantitation,the limits of detection and the linear equation results of residual solvents

2.2 定量限、檢測(cè)限以及線性關(guān)系考察

取“1.2.2”項(xiàng)下溶液,逐級(jí)稀釋,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,以信噪比S/N=10測(cè)得殘留溶劑定量限;以信噪比S/N=3測(cè)得殘留溶劑檢測(cè)限。

用二甲基亞砜將“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液分別稀釋成濃度為甲醇76.28～610.20 μg·mL-1,乙醇126.38～1011.00 μg·mL-1,乙酸乙酯127.53～1020.20 μg·mL-1,二氧六環(huán)10.30～82.40 μg·mL-1,乙酸126.5～1012.40 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μL,按“1.2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣,進(jìn)行測(cè)定。分別以甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)與乙酸峰面積(A)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度(C,μg·mL-1)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果甲醇在76.28～610.20 μg·mL-1、乙醇在126.38～1011.00 μg·mL-1、乙酸乙酯在127.53～1020.20 μg·mL-1、二氧六環(huán)在10.30～82.40 μg·mL-1、乙酸在126.5～1012.40 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)均不小于0.995。結(jié)果見表2。

2.3 精密度試驗(yàn)

取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6針,記錄色譜圖及峰面積,結(jié)果見表3。

由表3可知,甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙酸峰面積的RSD均小于10.0%,表明該方法精密度良好。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同批次泊馬度胺6份,按“1.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件方法進(jìn)樣,記錄色譜圖并計(jì)算RSD,結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Repeatability test results

由表4可知,甲醇、乙醇?xì)埩羯倭?RSD小于10.0%,乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙酸均未檢出,說明該方法重復(fù)性良好。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

取“2.4項(xiàng)”下的泊馬度胺樣品9份,每份約1.0 g,精密稱定,置10 mL量瓶中,分別精密加入混合對(duì)照品貯備液1、2、3 mL(每個(gè)濃度各3份),加二甲基亞砜溶解并稀釋至刻度,搖勻,制成濃度為50%、100%、150%的加樣供試品溶液。按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄色譜圖,按外標(biāo)法計(jì)算含量,并計(jì)算回收率,結(jié)果見表5～表9。

表5 甲醇回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Methanol recovery test results

表6 乙醇回收率測(cè)定結(jié)果Table 6 Ethanol recovery test results

表7 乙酸乙酯回收率測(cè)定結(jié)果Table 7 Ethyl acetate recovery test results

綜合表5～表9,甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)、乙酸在50%～150%濃度范圍內(nèi),平均回收率分別為100.9%、97.95%、100.0%、98.79%、98.90%,平均回收率介于97.0%～110.0%之間,說明本方法回收率良好。

2.6 耐用性

按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件,適當(dāng)調(diào)整分析條件,取“1.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣,考察分離度變化情況,評(píng)估測(cè)試結(jié)果受分析條件的變化影響程度,測(cè)定結(jié)果見表10。

表10 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Table 10 The results of durability test for GC

結(jié)果表明儀器分析條件適當(dāng)變動(dòng),各色譜峰之間相鄰峰之間最小的分離度均遠(yuǎn)大于1.5的要求,表明本法對(duì)色譜峰之間的分離滿足《中國(guó)藥典》2015年版的要求,故儀器的起始柱溫與載氣流速出現(xiàn)微小的偏差對(duì)試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果無影響。

表8 二氧六環(huán)回收率測(cè)定結(jié)果Table 8 Two oxygen and six rings recovery test results

表9 乙酸回收率測(cè)定結(jié)果Table 9 Acetic acid recovery test results

2.7 樣品測(cè)定

取中試三批泊馬度胺樣品,按“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液與對(duì)照品溶液制備方法制備供試品溶液與對(duì)照品溶液,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,記錄色譜圖,測(cè)定峰面積,外標(biāo)法計(jì)算。分析測(cè)定結(jié)果見表11。

表11 泊馬度胺原料殘留溶劑測(cè)定結(jié)果(%)Table 11 The determination results of residual solvents in pomalidomide

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部附錄0861殘留溶劑的限度規(guī)定,泊馬度胺質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定殘留溶劑甲醇不得超過0.3%、乙醇不得超過0.5%、乙酸乙酯不得超過0.5%、二氧六環(huán)不得超過0.038%、乙酸不得超過0.5%。結(jié)果表明,中試三批泊馬度胺此5種溶劑殘留均符合泊馬度胺原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及《中國(guó)藥典》2015年版的規(guī)定。

3 結(jié)論

泊馬度胺中殘留溶劑乙酸、甲醇、乙醇與二氧六環(huán)、乙酸乙酯極性差別較大,在分離過程中選用極性過大或過小的色譜柱都不能實(shí)現(xiàn)較好的分離。經(jīng)多次嘗試并結(jié)合文獻(xiàn)資料[9],本研究選用中等極性的DB-624色譜柱達(dá)到較好的分離效果。

不同沸點(diǎn)的溶劑分離快慢不同,低沸點(diǎn)的先分離,高沸點(diǎn)的后分離。甲醇沸點(diǎn)64.7 ℃,乙醇與乙酸乙酯沸點(diǎn)接近,二氧六環(huán)與乙酸沸點(diǎn)較高,最先分離出的是甲醇,最后分離出的是乙酸。經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)設(shè)置起始溫度為70 ℃,不同時(shí)間段測(cè)定對(duì)分離度影響較小,分離效果較好。

在預(yù)試的基礎(chǔ)上對(duì)分析方法進(jìn)行專屬性、檢測(cè)限、定量限、線性和范圍、精密度、準(zhǔn)確度及耐用性等考察驗(yàn)證,結(jié)果在專屬性試驗(yàn)中各溶劑能有效地分離(分離度大于1.5)、互不干擾,空白溶劑對(duì)檢測(cè)溶劑均無影響;檢測(cè)限與定量限均遠(yuǎn)低于檢測(cè)時(shí)的樣品溶劑限度;線性關(guān)系的相關(guān)系數(shù)均大于0.995;儀器與方法精密度良好,RSD均小于10.0%;各溶劑的回收率均在90%～110%之間,符合2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定在80%～120%之間的要求,表明準(zhǔn)確度良好;另適當(dāng)改變起始柱溫與載氣流速,分離度均達(dá)到要求。本方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強(qiáng),能滿足2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)溶劑殘留檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)要求。

經(jīng)過對(duì)三批中試樣品的檢測(cè),此5種殘留溶劑達(dá)到2015年版《中國(guó)藥典》的限度要求,故本方法適于泊馬度胺合成過程中有機(jī)溶劑甲醇、乙醇、乙酸乙酯、二氧六環(huán)與乙酸殘留量的檢測(cè),可作為泊馬度胺質(zhì)量控制的技術(shù)參考。