李松巖， 于 洋， 劉師兵， 崔萬麗， 徐 路， 孫 奇， 徐 冶△

(吉林醫(yī)藥學(xué)院 1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 2科研實驗室， 吉林 吉林 132013)

卵巢癌是全世界較為嚴重的婦科腫瘤之一，其發(fā)病率位居第7位，僅次于宮頸癌和子宮體癌[1-2]。長期以來缺少有效的治療藥物，治療后容易出現(xiàn)化療藥物耐藥，使卵巢癌的治療及預(yù)后效果不理想[3]。黃連素(berberine，Ber)是從黃連、黃柏和三顆針等植物中提取的一種生物堿，又稱小檗堿[4-6]，具有顯著的抗菌、抗心律失常、降血壓和調(diào)節(jié)血脂等作用[7]。研究表明，黃連素還具有較強的抗腫瘤作用[8-10]。然而，黃連素對腫瘤的作用機制尚不清楚。本研究通過黃連素作用人卵巢癌SKOV3細胞，探究黃連素對SKOV3細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)及自噬的作用。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

人卵巢癌SKOV3細胞購自上海中國科學(xué)院細胞庫。黃連素和MTT購自Sigma；抗beclin-1、泛素結(jié)合蛋白p62、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer binding protein homologous protein，CHOP)抗體均購自Santa Cruz；新生胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco；抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)抗體購自Abcam；相應(yīng)II抗購自長春德爾塔公司；Hoechst 33342熒光染料等購于北京鼎國公司；PVDF膜購自Milipore。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)和分組處理 用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，加入青霉素(1×105U/L)和鏈霉素(100 mg/L)，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期且生長狀態(tài)良好的細胞進行實驗。將細胞密度調(diào)整為8×106/L，每孔20 μL接種于96孔板，隨機分為正常對照組和黃連素12.5、25、50、100、200和400 μmol/L組，分別處理12 h、24 h和48 h后進行指標檢測。

2.2MTT方法檢測細胞活力 取2.1分組處理的細胞，每孔加入新配制MTT 200 μL，在細胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育4 h，棄去孔中培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL，并震蕩10 min，Model-680型酶標儀于490 nm波長測定吸光度(A490)。測3次，取平均值。細胞活力抑制率(%)=1-(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

2.3倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 細胞以1×108/L的密度接種于24孔板中，每孔500 μL，并置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。細胞長至80%密度后，隨機分為正常對照組、黃連素(50 μmol/L)組、黃連素(100 μmol/L)組和黃連素(200 μmol/L)組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞收縮、細胞密度情況，并記錄、照相。

2.4Western blot法檢測beclin-1、LC3、CHOP和GRP78的蛋白表達 將細胞隨機分為正常對照組、黃連素50 μmol/L組、黃連素100 μmol/L組和黃連素200 μmol/L組，培養(yǎng)24 h后，去掉細胞培養(yǎng)液，用胰酶進行消化，收集細胞，加入150 μL RIPA蛋白裂解液，超聲2次，每次3～5 s，4 ℃放置30 min，高速臺式冷凍離心機離心，并收集上清液。用BCA法進行蛋白定量。將SDS-PAGE結(jié)束后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，PBST洗3次，加入相應(yīng)的I抗，4 ℃過夜。次日用PBST洗3次，加入相應(yīng)的含有HRP標記的II抗，室溫孵育1.5 h；PBST洗5次，用ECL顯色液孵育，掃描紀錄。以β肌動蛋白作為內(nèi)參照，采用Quantity One軟件進行分析處理，以目標蛋白與內(nèi)參照的吸光度比值表示蛋白的相對表達量。

2.5間接免疫熒光法檢測p62和LC3的表達 高壓消毒后用無菌蓋玻片置于24孔板，取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞密度為1.0×107/L, 每孔500 μL接種過夜。次日待細胞生長至80%融合，藥物作用細胞24 h后，棄培養(yǎng)基，加入200 μL 4%多聚甲醛，作用。蛋白酶K消化1 min后，PBS洗滌3次，再用0.1% Triton-PBS作用5 min，PBS洗滌3次。加入5%非免疫動物血清作用30 min，加入相應(yīng)Ⅰ抗(1∶200)，4 ℃過夜，次日加入相應(yīng)Ⅱ抗，Hoechst 33342染色5 min，PBS洗滌3次，甘油封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察取圖。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，實驗均重復(fù)3次，組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法檢測SKOV3細胞活力

MTT實驗結(jié)果顯示，黃連素(12.5、25、50、100、200和400 μmol/L)對SKOV3細胞的活力具有明顯的抑制作用，且呈現(xiàn)濃度依賴性(r=0.973,P<0.05)；隨著黃連素作用時間的延長，對SKOV3細胞活力的抑制作用也逐漸增強，呈現(xiàn)時間依賴性(r=0.984,P<0.05)，見圖1。作用12 h，黃連素的IC50為(764.7±0.3)μmol/L；作用24 h，黃連素的IC50為(231.6±0.1)μmol/L；作用48 h，黃連素的IC50為(96.2±0.1)μmol/L。這些結(jié)果表示黃連素可顯著抑制SKOV3細胞的活力。

Figure 1. The effect of berberine (Ber) on the viability of human ovarian cancer SKOV3 cells measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1 MTT法檢測黃連素對SKOV3細胞活力的影響

2 黃連素對SKOV3細胞形態(tài)的影響

倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示，黃連素200 μmol/L可明顯抑制SKOV3細胞的生長，導(dǎo)致細胞收縮變圓，細胞密度稀薄，見圖2。

Figure 2. The effect of berberine on the morphological changes of SKOV3 cells (×250).

圖2 黃連素對SKOV3細胞形態(tài)的影響

3 間接免疫熒光法檢測自噬標志蛋白p62和LC3的共定位

激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示，與正常對照組相比，黃連素作用24 h后，可見LC3(FITC標記)與p62(rhodamine標記)蛋白散在分布，且熒光強度增加的同時呈現(xiàn)點狀聚集，在黃連素(200 μmol/L)組可見明顯增強，且有明顯的共定位現(xiàn)象，見圖3。

4 黃連素對SKOV3細胞p62、beclin-1、CHOP、LC3和GRP78蛋白表達的影響

Western blot法檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，隨著黃連素藥物濃度的增加，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP表達顯著上升(P<0.05或P<0.01)。

Figure 3. The effect of berberine (Bear) on p62 and LC3 protein co-localization in SKOV3 cells (confocal laser scanning microscopy,×800).

圖3 共聚焦顯微鏡觀察黃連素對SKOV3細胞LC3和p62蛋白共定位的影響

與空白對照組相比，隨著黃連素藥物濃度的增加，自噬相關(guān)蛋白p62、beclin-1和LC3表達顯著升高(P<0.05或P<0.01)，見圖4。

Figure 4. The effect of berberine (Ber) on the protein expression of beclin-1, LC3, p62, CHOP and GRP78 in the SKOV3 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖4 Western blot法檢測SKOV3細胞中相關(guān)蛋白的表達

討 論

卵巢癌作為一種常見的女性惡性腫瘤，在臨床治療中常常面臨著化療藥物耐藥的重大難題。研究表明，產(chǎn)生化療藥物耐藥的原因可能與ERS引起的自噬和凋亡有著密切的關(guān)系[11]。目前，尋找到新的抗腫瘤藥物成為首要任務(wù)。黃連素是從中藥黃連中提取出的一種異喹啉生物堿，其價格低廉，不良反應(yīng)小?，F(xiàn)代研究表明，黃連素具有抗炎、抗腫瘤、抗病原微生物、調(diào)節(jié)脂代謝和免疫抑制等作用[3-4, 6, 8]。本研究結(jié)果表明，黃連素作用于人卵巢癌SKOV3細胞后，細胞活力下降，細胞收縮變圓，細胞密度也明顯下降，存在時間和劑量依賴性，這與已報道結(jié)果一致[11]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞行駛正常功能的重要組成部分,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔是一個獨立的細胞環(huán)境。當錯誤折疊與未折疊蛋白聚集、鈣離子平衡紊亂時[12]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究表明，黃連素可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，來調(diào)節(jié)細胞凋亡和炎癥的發(fā)生、氧化應(yīng)激及能量代謝等[4,6-7, 9, 12]。自噬是調(diào)控細胞死亡及細胞功能的利刃，具有雙面性，細胞的自噬現(xiàn)象常常伴隨著凋亡同時出現(xiàn)[13]。在不同的細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬之間有著復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系[14]。研究表明，黃連素是較好的自噬激活劑，其可以通過調(diào)節(jié)自噬改變線粒體動力學(xué)，影響細胞的能量攝取和物質(zhì)代謝，并導(dǎo)致細胞凋亡[15]。然而，黃連素與腫瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬調(diào)節(jié)之間的分子機制尚待進一步研究。

本研究表明，隨著黃連素藥物濃度的增加，SKOV3細胞的活力逐漸降低。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，隨著黃連素藥物濃度的增加，SKOV3細胞中LC3和p62蛋白表達逐漸增強。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78和CHOP及自噬相關(guān)蛋白beclin-1和LC3的表達顯著增強。結(jié)果表明，黃連素可以誘導(dǎo)SKOV3細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬。本研究為卵巢癌的治療提供理論依據(jù)，并為中藥治療卵巢癌策略提供新線索。黃連素是否可用來治療卵巢癌還需進一步的研究。