李 建，冷錦紅

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032）

痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，主要累及感覺神經(jīng)和運動神經(jīng)，產(chǎn)生感覺及運動障礙。3%～25%的糖尿病患者會經(jīng)歷這種神經(jīng)病理性疼痛，表現(xiàn)為肢體的疼痛、麻木，嚴(yán)重者會形成潰瘍或壞疽，最終選擇截肢，嚴(yán)重地影響了患者的生活質(zhì)量［1］。由于其發(fā)病機制尚未闡明，現(xiàn)有的治療只能緩解癥狀，而尚未有有效的治療方法來逆轉(zhuǎn)痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的進展。

穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipppnicaMak.的干燥根，具有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)、活血止痛等功效，在治療腰腿疼痛、筋骨麻木、風(fēng)寒濕痹、跌打損傷等疾病有明顯療效?，F(xiàn)代藥理研究表明，穿山龍有抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、降血脂、鎮(zhèn)咳平喘等多種藥理作用。有關(guān)穿山龍單品或提取物治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的研究近年來多見報道［2-3］，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制尚不明確。本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)［4］出發(fā)，從系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)的角度在分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的層面，通過對穿山龍藥效成分進行計算機虛擬篩選，構(gòu)建穿山龍活性成分-靶點-信號通路相互作用網(wǎng)絡(luò)，認(rèn)識中藥穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變多成分、多靶點、多途徑的整體作用機制。以期揭示穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的藥效基礎(chǔ)，為更好的開發(fā)治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變藥物提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 分析平臺 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實驗研究的主要材料是分析軟件和數(shù)據(jù)庫，本研究中采用的數(shù)據(jù)庫和分析軟件主要有中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php，Version：2.3）、TCM Database＠taiwan 數(shù)據(jù)庫（http：//tcm.cmu.edu.tw／）、Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）、Molinspiration 網(wǎng)站（http：//www.molinspiration.com／cgi-bin／properties）、PharmMapper 服務(wù)器（http：//59.78.98.102／pharmmapper／index.php）、UniProt 數(shù)據(jù)庫（http：//www.uniprot.org／）、Genecards 數(shù)據(jù)庫（http：//www.genecards.org／）、String 10.5 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org／cgi／input.pl）、DAVID 6.8 數(shù)據(jù)（https：//david.ncifcrf.gov／home.jsp）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp／kegg／）、CTD 數(shù)據(jù)庫（http：//ctdbase.org／）、Cytoscape 3.5.1 軟件。

1.2 化學(xué)成分的獲得 以“穿山龍、穿龍薯蕷”為關(guān)鍵字，分別檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）和臺灣中醫(yī)藥資料（TCM Database＠taiwan），并參考國內(nèi)外文獻，對穿山龍的化學(xué)成分信息進行收集。將收集的化學(xué)成分逐一輸入至Pubchem 數(shù)據(jù)庫，下載這些成分的分子結(jié)構(gòu)圖，以?.mol 的格式存儲。

1.3 類藥性分析 Lipinski 類藥性五規(guī)則是藥物分子設(shè)計和藥物篩選的常用規(guī)則之一，可以比較準(zhǔn)確地預(yù)測藥物中化合物的吸收或滲透性能，使藥物開發(fā)者能夠盡早準(zhǔn)確地篩選出有效藥物成分，降低藥物開發(fā)成本。將上述已獲得的化合物在Molinspiration 網(wǎng)站中預(yù)測其吸收性質(zhì)。之后依據(jù)LR［5］原則，對數(shù)據(jù)庫分析出的穿山龍化學(xué)成分進行篩選：（1）相對分子量（MW）≤500；（2）氫鍵供體（與O 和N連接的氫原子數(shù)nOHNH）≤5；（3）氫鍵受體（O 和N 的數(shù)量，nON）≤10；（4）脂水分配系數(shù)（miLogP）≤4.15。滿足上述至少2 種條件的化合物為口服活性藥物。若數(shù)據(jù)庫中化合物不符LR 原則但已有相關(guān)報道明確為穿山龍活性成分的化合物予以納入。

1.4 靶點的預(yù)測與篩選 PharmMapper 數(shù)據(jù)庫采用“反向藥效團匹配方法”，以活性小分子為探針、搜尋潛在藥物靶標(biāo)、進而預(yù)測化合物生物活性［6］。因此，登陸Pharm-Mapper 數(shù)據(jù)庫上傳穿山龍活性成分的?.mol 格式文件，將“Maximum Generated Conformations”值設(shè)為300，“Select Targets Set”設(shè) 為 Human Protein Targets Only（v2010，2241），“Number of Reserved Matched Targets（Max 1，000）”設(shè)為300，收集排名前100 的靶點。由于檢索到的藥物靶點存在命名不規(guī)范等問題，因此，本研究使用UniProt 數(shù)據(jù)庫中UniProtKB 搜索功能，通過輸入蛋白名稱并限定物種為人，將檢索得到的所有蛋白校正為其官方名稱，經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉(zhuǎn)化操作，獲取與活性成分相關(guān)的蛋白信息，去除重復(fù)靶點后，同時獲取這些靶點相應(yīng)的基因名稱。利用Genecards 數(shù)據(jù)庫以“Painful diabetic peripheral neuropathy”為關(guān)鍵詞，檢索已報道的與痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)的基因，與上述PharmMapper 數(shù)據(jù)庫返回的靶點進行匹配，作為穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在作用靶點。

1.5 靶點通路注釋分析 通過DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫對獲得的靶點蛋白進行GO 富集分析和KEGG 通路注釋分析，藥物靶點富集的信號通路被認(rèn)為是藥物作用的重要通路。在CTD 數(shù)據(jù)庫上以“Painful diabetic peripheral neuropathy”“diabetic neuropathy”為關(guān)鍵詞檢索痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)信號通路，將得到的通路與上述通路進行匹配分析，作為穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在通路。

1.6 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 為了闡明靶點蛋白在系統(tǒng)水平上的作用，本研究將穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的靶點蛋白導(dǎo)入String 10.5 數(shù)據(jù)庫中，限定物種為人，通過參數(shù)設(shè)置將評分條件設(shè)定為＞0.90，以保證信息的高置信度，獲取蛋白相互作用關(guān)系，結(jié)果保存成TSV格式，并將文件中的node1、node2 和combined score 信息導(dǎo)入到Cytoscape 軟件繪制相互作用網(wǎng)路，將節(jié)點大小和顏色設(shè)置用于反映Degree 的大小，邊的粗細(xì)設(shè)置用于反映Combine score 的大小，導(dǎo)出可視化圖形進行研究分析。

1.7 構(gòu)建“活性成分-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖 將27 個活性成分的預(yù)測靶點結(jié)果和通路分析，在Excel 表中分別構(gòu)建“活性成分-靶點”“靶點-通路”之間的相互關(guān)系，然后將其導(dǎo)入到Cytoscape3.5.1 軟件中建立“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。圖中以活性成分、靶點蛋白和通路為3類節(jié)點（node），它們之間有相互關(guān)系的分別用邊（edge）相連，節(jié)點的Degree 越大，則節(jié)點的大小越大，圖中三角形節(jié)點代表活性成分，圓形節(jié)點代表靶點，菱形節(jié)點代表信號通路，經(jīng)Cytoscape 3.5.1 軟件處理，得到穿山龍相關(guān)靶點通路預(yù)測圖。在此基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)分析，探究其治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的機制。

2 結(jié)果

2.1 穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的活性成分篩選 通過Database＠taiwan 數(shù)據(jù)庫、TCMSP、Pubchem 和文獻檢索［7-8］的方式，收集到45 種化學(xué)成分，對其進行類藥性分析，以進一步獲得活性成分。此外，穿山龍中薯蕷皂苷、纖細(xì)皂苷雖不符合LR 原則，但已有研究［7］表明這兩種化合物為穿山龍中含有量較高的活性成分，故均予納入研究，因此共得到活性成分27 種。為方便后續(xù)研究，將它們分別編號為D1～D45，其中D1～D27 為穿山龍的潛在活性成分。詳見表1。

2.2 穿山龍的主要活性成分靶點預(yù)測結(jié)果 通過Pharm-Mapper 服務(wù)器反向分子對接實驗，預(yù)測出了27 種活性成分的作用靶點為316 個。通過與GeneCards 數(shù)據(jù)庫搜索到的靶點進行匹配，篩選出穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變靶點129 個。其中，化合物diosgenin acetate（D12）、diosgenin-3，6-dione（D23）、1，7-bis（4-hydroxyphenyl）hepta-4E，6E-dien-3（D25）對應(yīng)的潛在靶點最多，達到57個，提示了化合物D12、D23、D25 可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在有效成分。

2.3 GO 生物過程分析 通過對穿山龍活性成分作用靶點GO 富 集 分 析，結(jié)果 表 明，在 生 物 學(xué) 過 程（biological process）方面（圖1），主要參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白水解、氧化還原、對缺氧的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、MAPK 級聯(lián)等生物過程；在細(xì)胞組分（cellular component）方面（圖2），主要存在于細(xì)胞質(zhì)、核、質(zhì)膜、線粒體等細(xì)胞組分當(dāng)中；在分子功能（molecular function）方面（圖3），主要參與蛋白質(zhì)結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白激酶活性、類固醇激素受體活性等分子功能。

2.4 KEGG 代謝通路分析 將穿山龍129 個治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的靶點導(dǎo)入到DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫中進行通路分析，取P＜0.05 的通路，通過KEGG、CTD 數(shù)據(jù)庫及文獻挖掘等方式，對計算出的通路進行綜合分析。結(jié)果共富集到90 條信號通路，其中與痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變密切相關(guān)的有33 條（表2），涉及PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、PPAR signaling pathway 等信號通路。富集結(jié)果表明，大多數(shù)基因顯著富集到PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signaling pathway 這3 條信號通路上，表明這些通路可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵通路。

表1 45 個化合物信息

圖1 穿山龍主要活性成分的生物過程（BP）富集分析

圖2 穿山龍主要活性成分的細(xì)胞成分（CC）富集分析

圖3 穿山龍主要活性成分的分子功能（MF）富集分析

2.5 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 為了更好地理解穿山龍的作用機制，基于PPI 關(guān)系，利用String 10.5 數(shù)據(jù)庫獲取穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的靶點蛋白之間相互作用的關(guān)系，并導(dǎo)入到Cytoscape 3.5.1 軟件中繪制相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖4。節(jié)點的大小和顏色表示Degree 值的大小，節(jié)點大小越大，顏色由橙色變藍(lán)色對應(yīng)的Degree 值越大；邊的粗細(xì)表示Combine score，邊越粗Combine score 值越大。PPI 網(wǎng)絡(luò)包含129 個蛋白質(zhì)節(jié)點，290 條相互作用關(guān)系（連線），平均Degree 為4.8，其中節(jié)點表示靶點蛋白，每條邊表示靶點蛋白之間的作用關(guān)系。根據(jù)節(jié)點的Degree 繪制出Degree 排名前15 的Hub 蛋白質(zhì)節(jié)點的條形圖（圖5）。包括原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞基α（PIK3R1）、GTPase HRas（HRAS）、促分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、酪氨酸蛋白激酶JAK2（JAK2）、胰島素樣生長因子I（IGF1）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等。穿山龍靶點蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖顯示，這些靶點是網(wǎng)絡(luò)的樞紐節(jié)點，是穿山龍抗痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的核心靶點。

表2 KEGG 代謝通路

圖4 穿山龍靶蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)

圖5 各蛋白信息

2.6 穿山龍活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用Cytoscape 3.5.1 軟件構(gòu)建穿山龍活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。直觀地呈現(xiàn)了27 個活性成分、129 個靶蛋白、33 條作用通路和痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變疾病間的關(guān)聯(lián)（圖6）。由此可見，穿山龍主要活性成分的作用靶點分布于不同的通路，相互協(xié)調(diào)、共同調(diào)節(jié)藥物治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機制。從穿山龍活性成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖中可知，穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機制與代謝紊亂、血管損害、氧化應(yīng)激的損傷、炎癥反應(yīng)、自身免疫的損傷等多種發(fā)病學(xué)說均有相關(guān)性，可從不同角度揭示穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機制。

圖6 化合物-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

目前，痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機制尚未完全明確，研究認(rèn)為痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病機制與代謝紊亂、血管損害、神經(jīng)營養(yǎng)因子、氧化應(yīng)激的損傷、炎癥反應(yīng)、自身免疫的損傷、遺傳因素、神經(jīng)元細(xì)胞膜離子通道功能障礙、蛋白激酶C（PKC）、致痛因子等因素相關(guān)。因此，痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療主要通過控制血糖、營養(yǎng)神經(jīng)、改善循環(huán)、改善代謝、抗氧化應(yīng)激、抗炎鎮(zhèn)痛等方式改善癥狀［9］。

穿山龍中的薯蕷皂苷元與薯蕷皂苷均為已報道的具有抗痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變作用的活性成分。本實驗前期研究已表明［3］，中藥穿山龍?zhí)崛∥锸硎氃碥眨―2）可明顯減少糖尿病大鼠血清致痛物質(zhì)HA 和5-HT 的表達，療效強于強的松。已有研究［2］表明，薯蕷皂苷元（D1）可改善STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠氧化應(yīng)激和炎癥水平以及抗氧化能力，增加機械痛閾和熱痛閾值并降低疼痛。網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，化合物D1、D2 連接的靶點分子數(shù)目較多分別是54、44，因此，這兩種活性成分是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵成分。除此之外，未見其他化學(xué)成分有治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的報道。本研究對獲取的27 種具有相關(guān)生物活性的化學(xué)成分進行分析，發(fā)現(xiàn)diosgenin acetate（D12）、diosgenin-3，6-dione（D23）、1，7-bis（4-hydroxyphenyl）hepta-4E，6E-dien-3（D25）等對應(yīng)的痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變相關(guān)靶點個數(shù)最多，說明該成分可能是穿山龍發(fā)揮抗痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變作用的重要成分，為進一步篩選其有效成分提供了理論依據(jù)。

蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)顯示，排名前15 的Hub 蛋白包括SRC、PIK3R1、STAT1、MAPK1、JAK2、IGF-1、IL-2 等。據(jù)報道，Src 激酶可通過調(diào)節(jié)TRPV1 通道，從而緩解STZ 誘導(dǎo)的糖尿病小鼠機械性異常性疼痛［10］。Mauvais-Jarvis［11］研究發(fā)現(xiàn)，PI3-激酶在胰島素的代謝作用中起著核心作用，通過雜合破壞PIK3R1 基因可降低p85α，AS53 和p50α 的水平提高胰島素敏感性，降低空腹和餐后血糖水平，并顯著降低與遺傳性胰島素抵抗相關(guān)的糖尿病發(fā)病率；Chu 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性胰島素樣生長因子-1（IGF-1）治療可逆轉(zhuǎn)糖尿病周圍神經(jīng)病變小鼠的痛覺過敏現(xiàn)象并改善其活動能力，文獻證明這些基因大都涉及炎癥、氧化應(yīng)激和胰島素信號調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)，它們參與了痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變基本病理生理過程。

穿山龍的靶點GO 富集分析結(jié)果表明穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白水解、氧化還原、對缺氧的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化、MAPK 級聯(lián)等生物過程，涉及細(xì)胞質(zhì)、核、質(zhì)膜、線粒體等細(xì)胞組分，涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、鋅離子結(jié)合、蛋白激酶活性、類固醇激素受體活性等分子功能，是一個復(fù)雜的過程。KEGG 通路分析顯示，穿山龍可能通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、VEGF 信號通路、PPAR 信號通路、TLRS 信號通路、JAK／STAT 信號通路等信號傳導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)血糖、抗氧化應(yīng)激、抗炎鎮(zhèn)痛從而發(fā)揮治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用。

PI3K-Akt 信號通路存在機體內(nèi)多種細(xì)胞中，對細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運等多種生物過程起重要的調(diào)節(jié)作用。已有研究表明［13］，持續(xù)抑制PI3K／Akt 信號通路可緩解糖尿病神經(jīng)病理痛的癥狀并改善其神經(jīng)功能。此外，PI3K-Akt 信號傳導(dǎo)通路的阻滯是外周組織胰島素抵抗及2型糖尿病發(fā)生的最基本機制之一［14］。在KEGG 分析中，PI3K-Akt 信號通路是富集基因最多的信號通路，因此，推測穿山龍可通過抑制PI3K-Akt 信號通路，減輕疼痛癥狀的同時改善胰島素抵抗，這為痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的治療提供新方向，有望通過調(diào)控PI3K／Akt 信號通路來預(yù)防其發(fā)生。

MAPK 信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1／2（ERK1／2），c-Jun 氨 基（N）-末 端 激 酶 1／2／3（JNK1／2／3），p38MAPK 和ERK5 四條途徑［15］。MAPK 信號通路與腫瘤、炎癥、氧化應(yīng)激密切相關(guān)［16-17］。王超等［18］研究發(fā)現(xiàn)，通心絡(luò)膠囊能夠降低糖尿病周圍神經(jīng)病變小鼠氧化應(yīng)激損失，改善坐骨神經(jīng)中SOD、MDA、p-p38MAPK 的表達，同時能夠提高痛閾值和神經(jīng)傳導(dǎo)速度；Sweitzer 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，p38αMAPK 抑制劑SD-282 可改善STZ 誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的機械性異常性疼痛、熱痛覺過敏及福爾馬林誘導(dǎo)的炎性疼痛，因此，通過干預(yù)MAPK 信號通路對糖尿病周圍神經(jīng)病變具有一定的保護作用。在KEGG 分析中，MAPK 信號通路是富集基因較多的信號通路，因此推測MAPK 通路可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵通路。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管生成的主要介質(zhì)，VEGF 在糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)病機制中起重要作用。Di等［20］發(fā)現(xiàn)VEGF-B 可以減輕糖尿病小鼠感覺神經(jīng)元中過量分泌的ROS，提示VEGF-B 的神經(jīng)保護作用可能通過激活糖尿病感覺神經(jīng)元的抗氧化防御實現(xiàn)；Li 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，紅花提取物和乙酰谷酰胺（SA）注射液能減輕糖尿病周圍神經(jīng)病變引起的神經(jīng)損傷，其保護作用可能與促進VEGFB，NGF 和GDNF 的表達有關(guān)。VEGF-B 不僅可以保護中樞神經(jīng)，還可以促進周圍神經(jīng)的損傷修復(fù)。在KEGG 分析中，VEGF 信號通路是富集基因較多，因此，調(diào)節(jié)VEGF 信號通路可能是穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的關(guān)鍵通路之一。

Toll 樣受體（TLRs）是涉及先天免疫和病原體識別的天然免疫受體。TLR 通過募集銜接蛋白活化核因子-κB（NF-κB）、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、干擾素（IFN）調(diào)節(jié)因子，來激動多個信號傳導(dǎo)途經(jīng)，以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，趨化因子和干擾素在炎癥中的表達，在固有免疫系統(tǒng)中起著重要作用［22-23］。Yan 等［24］在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的痛覺過敏糖尿病大鼠中發(fā)現(xiàn)TLR4 mRNA 表達上調(diào)，此外，TLR4 表達與機械刺激的爪壓撤回閾值和對熱刺激的爪縮回潛伏期有關(guān)。TLR4 信號通路的兩種下游促炎細(xì)胞因子TNF-α 和IL-1β 的蛋白水平也顯著升高，并與糖尿病大鼠的機械／熱超敏反應(yīng)相關(guān)。最近有研究顯示［25］，薯蕷皂苷可通過調(diào)節(jié)TLR4 ／MyD88 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥，對脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷起保護作用。因此，筆者推測Toll 樣受體信號通路可能是穿山龍發(fā)揮抗炎作用一條通路。

JAK-STAT 信號通路是近年發(fā)現(xiàn)的一條由細(xì)胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫和炎癥等許多重要的生物學(xué)過程［26］。最近有報道稱，JAK／STAT 通路失調(diào)導(dǎo)致肥胖和糖尿病的發(fā)生［27］。Ma 等［28］發(fā)現(xiàn)抗氧化劑如白藜蘆醇可通過抑制JAK／STAT 信號通路來抑制小鼠巨噬細(xì)胞中的炎癥通路；Liu 等［29］在STZ 誘導(dǎo)的糖尿病心肌纖維化大鼠中發(fā)現(xiàn)硫化氫（H2S）可改善糖尿病大鼠心肌纖維化，其機制可能與下調(diào)JAK ／STAT 信號通路有關(guān)，從而抑制氧化應(yīng)激和ER 應(yīng)激，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。因此，JAK ／STAT 信號通路可能是穿山龍發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激的一條潛在通路。

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是參與多種生理過程的配體激活轉(zhuǎn)錄因子，在諸如葡萄糖和脂質(zhì)代謝，能量平衡，細(xì)胞增殖，炎癥，免疫和腫瘤等方面均有著舉足輕重的作用。PPARs 由PPARα、PPARβ 和PPARγ 3 種亞型組成［30］，其中PPARγ 是PPAR 通路最為重要的靶點，PPARγ 具有抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用［31］。目前，PPARs 激動劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于糖尿病、脂質(zhì)紊亂、代謝綜合征等疾病的臨床治療。說明了穿山龍可能通過作用于PPARγ 蛋白調(diào)控PPAR 通路來調(diào)節(jié)血糖、改善炎癥和氧化應(yīng)激。此外，KEGG 分析顯示穿山龍還可通過INSR、MAPK1 等靶點與胰島素信號通路、AMPK 信號通路來控制糖脂代謝的正常運行。

痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變在中醫(yī)學(xué)中屬于“消渴痹癥”范疇，消渴日久，損傷氣陰，氣血運行不暢致瘀血阻滯絡(luò)脈，絡(luò)脈淤閉，不通則痛，因此，“血瘀”和“絡(luò)損”是消渴痹癥的基本病機之一。中藥穿山龍具有活血通絡(luò)止痛之功效，對于“絡(luò)脈瘀阻”所致的該疾病具有良好療效。張?zhí)m教授［32］認(rèn)為除微血管和微循環(huán)之外，神經(jīng)組織在形態(tài)和功能上與中醫(yī)的“絡(luò)脈”也很類似，并將其歸屬“絡(luò)脈”范疇；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)病主要受兩方面因素影響，即血液供應(yīng)受損的血管因素和神經(jīng)元或神經(jīng)纖維內(nèi)部因高血糖導(dǎo)致病理生理改變的代謝因素［33］，這與中醫(yī)“血瘀絡(luò)損”的病機觀有一定相似性。本研究根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，預(yù)測了穿山龍活血通絡(luò)止痛的治療機制可能通過調(diào)節(jié)血糖，改善氧化應(yīng)激水平，減輕神經(jīng)血管損傷，抑制炎癥反應(yīng)，從而緩解糖尿病神經(jīng)病理性疼痛。

綜上所說，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，通過靶點預(yù)測、類藥性分析、GO 基因富集分析和KEGG 通路注釋分析技術(shù)構(gòu)建了穿山龍靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)，從系統(tǒng)層面研究了穿山龍活性成分治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變多成分-多靶點-多信號通路的作用機制。從理論預(yù)測、整體分析角度，闡明了穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的潛在作用機制，為未來驗證穿山龍治療痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用機制提供了思路與線索。