楊崇儀　吳凡　張紅宇　王莉　王瑋

【摘 要】 目的：研究建立運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定血塞通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷R、三七皂苷R1的定性定量方法，用于血塞通注射液的質(zhì)量控制。方法：采用CAPCELL CORE C18色譜柱（2.1mm×150mm， 2.7μm），柱溫30℃，流動(dòng)相：A（超純水）和 B（乙腈），使用梯度洗脫如下：0.01～3.00min，95%A;3.00～4.00min，95%A～30%A;4.00min～10.00min，30%A;10.00min～12.00min，30%A～95%A; 12.00min～15.00min，95%A。流速設(shè)定為 0.300mL/min?？傔\(yùn)行時(shí)間為15.0min。采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的掃描方式下正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)，離子源為 ESI 源。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均高于 0.9988;日內(nèi)精密度和日間精密度（RSD）分別小于 4.14%和 4.87%;回收率在 94.3%～106.9%之間。被分析成分48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。結(jié)論：建立并驗(yàn)證了運(yùn)用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定血塞通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷R、三七皂苷R1的定性定量方法，該方法已成功地應(yīng)用于云南地產(chǎn)的9批次的血塞通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1的定性和定量分析。

【關(guān)鍵詞】 血塞通注射液;高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;人參皂苷;三七皂苷

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）13-0034-10

三七（Panax notoginseng （Burk.）F. H. Chen）為五加科人參屬植物，是我國(guó)名貴中藥材，是云南道地中藥材資源。血塞通注射液為三七提取物制劑，主要成份為三七總皂苷，有活血祛瘀、通脈活絡(luò)等功效，主要用于中風(fēng)偏癱、瘀血阻絡(luò)證，動(dòng)脈粥狀硬化性血栓性腦梗塞、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞見瘀血阻絡(luò)證者，臨床應(yīng)用廣泛并且療效確切，是一種具有重要應(yīng)用前景的中藥品種。血塞通注射液的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3590-2001（Z）-2011，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的含量測(cè)定所用方法為HPLC法[1]，檢測(cè)時(shí)間為60min，耗時(shí)較長(zhǎng)而且靈敏度低。其主要成分三七總皂苷和三七三醇皂苷的含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法收載于《中國(guó)藥典》2015版[2、3]，三七三醇皂苷的測(cè)定也采用HPLC法，測(cè)定時(shí)長(zhǎng)為90分鐘。LC-MS/MS技術(shù)是近年最新發(fā)展起來的重要的分離和分析方法，擁有液相色譜的優(yōu)越分離性能，串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）相較于單質(zhì)譜（MS）具有更高選擇性、更高靈敏度和更高準(zhǔn)確度，LC-MS/MS具有分析范圍廣，分離能力強(qiáng)，定性分析結(jié)果可靠，自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)[4]。運(yùn)用LC-MS/MS技術(shù)能夠避免繁瑣和復(fù)雜的衍生化前處理，同時(shí)能夠得到化合物保留時(shí)間、分子量及特征離子對(duì)等豐富的信息。在對(duì)未知成分的研究中，通過質(zhì)譜檢測(cè)器給出的大量結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合同類已知結(jié)構(gòu)化合物的裂解規(guī)律，即可對(duì)未知成分進(jìn)行分析;在已知成分的測(cè)定中，相較于傳統(tǒng)色譜法具有更高準(zhǔn)確度和靈敏度[5]。檢索現(xiàn)有的研究文獻(xiàn)，對(duì)血塞通注射液進(jìn)行有效成分測(cè)定的方法多為液相色譜法[6-13]，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)最短為24min[7]，應(yīng)用LC-MS/MS測(cè)定三七總皂苷中一個(gè)或幾個(gè)皂苷成分的研究文獻(xiàn)也有報(bào)道，但研究對(duì)象為三七原料[14-15]或其他品種的注射液[16]，應(yīng)用LC-MS/MS對(duì)血塞通注射液中三七總皂苷進(jìn)行測(cè)定的文獻(xiàn)未見報(bào)道。研究建立一種運(yùn)用LC-MS/MS法對(duì)血塞通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1快速準(zhǔn)確定量的方法，相對(duì)于血塞通注射液的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，大大提高了檢測(cè)效率。并成功運(yùn)用該方法對(duì)來自云南不同生產(chǎn)企業(yè)的血塞通注射液進(jìn)行了含量測(cè)定，為云南血塞通注射液的生產(chǎn)企業(yè)提供了提升藥品標(biāo)準(zhǔn)、提高藥品質(zhì)量的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-30A高效液相色譜儀（含在線脫氣機(jī)、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器，日本島津公司）、TRIPLE QUAD 5500型質(zhì)譜儀（美國(guó) AB Sciex公司）、CPA225D 型分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）、UPH-IV-90Z優(yōu)普超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）。

1.2 材料 人參皂苷Rg1（Ginsenoside Rg1，批號(hào)：110703-201529，純度95.0%）、人參皂苷Rb1（Ginsenoside Rb1，批號(hào)：110704-201424，純度93.7%）、人參皂苷Re（Ginsenoside Re，批號(hào)：110754-201525）、人參皂苷Rd（Ginsenoside Rd，1批號(hào)：10704-201424）、三七皂苷R1（Notoginsenoside R1，批號(hào)：110745-201318）和三七總皂苷（Notoginseng Total Saponins，批號(hào)：110870-201002，含量以三七皂苷R1 6.9%、人參皂苷Rg1 28.0%、人參皂苷Rb1 29.7%、人參皂苷Re 3.8%、人參皂苷Rd 7.3%計(jì)）以上對(duì)照品購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇（色譜級(jí)，德國(guó)默克公司），乙腈（色譜級(jí)，德國(guó)默克公司），超純水。血塞通注射液收集于云南省不同企業(yè)，具體見表1。各待測(cè)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見圖1。

2 方法

2.1 分析條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL CORE C18柱（2.1mm I.D.×150mm， 2.7μm，SHISEIDO）;柱溫：30℃;流動(dòng)相： A-B（水-乙腈）梯度洗脫，梯度洗脫程序如下，見表2;分析時(shí)間為 15.0min;流速：0.300mL/min;進(jìn)樣量：1.00μL。對(duì)照品的提取 MRM 色譜圖和樣品的MRM色譜圖比對(duì)見圖2。

2.1.2 質(zhì)譜條件 采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）的掃描方式下正負(fù)離子同時(shí)監(jiān)測(cè)，離子源為 ESI 源，源噴射電壓設(shè)置為 5500 和-4500 V，源溫度（TEM）550℃，霧化氣壓力為55 psi，接口持續(xù)加熱，碰撞反應(yīng)氣使用氮?dú)?，氣簾氣壓力?35 psi，Q1 和 Q3 分辨率均為 0.1Da，駐留時(shí)間（dwell time）為 80 ms。

將每個(gè)皂苷成分的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1對(duì)照品溶液（濃度約1μg/mL）分別打入質(zhì)譜中，用MRM模式正負(fù)離子同時(shí)掃描，對(duì)前體離子（Q1）、產(chǎn)物離子（Q3）、去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE）進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)在正離子模式下，五種皂苷成分的響應(yīng)強(qiáng)度均優(yōu)于負(fù)離子的響應(yīng)強(qiáng)度。本實(shí)驗(yàn)采用正離子對(duì)定量、負(fù)離子對(duì)定性的方式對(duì)五種皂苷成分進(jìn)行測(cè)定。由于負(fù)離子對(duì)不用于定量檢測(cè)，所以未對(duì)負(fù)離子對(duì)進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。正離子模式下的監(jiān)測(cè)離子對(duì)、去簇電壓（DP）及碰撞能量（CE）見表3。數(shù)據(jù)處理采用 AB Sciex公司提供的 Analyst軟件，1.6版本。五種皂苷成分的一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的主要裂解碎片見表3和圖3。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1對(duì)照品適量，使用甲醇溶解并配制成一定濃度的貯備液，供質(zhì)譜條件優(yōu)化用。取三七總皂苷對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并定容，制得三七總皂苷儲(chǔ)備液，濃度為含三七總皂苷1.0775mg/mL。于-20℃下保存。

2.3 供試品溶液的制備 取血塞通注射液適量，按照一定比例，用甲醇稀釋定容后，用0.45μm濾膜過濾后制得供試品溶液，于4℃下保存。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限 取三七總皂苷儲(chǔ)備液，采用梯度稀釋法，用甲醇由高到低分別稀釋成8個(gè)濃度（4310ng/mL，2155ng/mL，1077.5ng/mL，538.75ng/mL，269.38ng/mL，134.69ng/mL，67.34ng/mL），0.45μm濾膜過濾后，取1.0μL進(jìn)樣，記錄峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。將三七總皂苷儲(chǔ)備液用甲醇逐步稀釋并進(jìn)行測(cè)定，以信噪比S/N=10和S/N=3時(shí)各對(duì)照品溶液的濃度為定量限和檢測(cè)限。

2.4.2 精密度、回收率和穩(wěn)定性 取血塞通注射液，按照適當(dāng)比例稀釋，得到中間液，再將中間液用兩倍的稀釋梯度稀釋為高、中、低三個(gè)不同濃度的供試液，用0.45μm濾膜過濾后，取1μl進(jìn)樣，每個(gè)濃度的供試液平行測(cè)定6份，按“2.1”項(xiàng)下的分析條件對(duì)供試液中的人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、三七皂苷R1進(jìn)行定量分析記錄峰面積，帶入當(dāng)日制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出5個(gè)皂苷的濃度，并計(jì)算RSD值。供試液于4℃下保存，于24h后同法再次測(cè)定，計(jì)算出5個(gè)皂苷的濃度，并計(jì)算RSD值。

取供試品溶液，于4℃下保存，分別于0h、24h、48h 測(cè)定五種皂苷的濃度，平行測(cè)定6份，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。

精密量取供試品溶液1.0mL，加入甲醇1.0mL旋渦混勻后，取1.0μL進(jìn)樣，測(cè)定五種皂苷的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算濃度（記錄為A濃度）。精密量取高、中、低（4156ng/mL、2078ng/mL、1039ng/mL）三個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液1.0mL，分別加入到1.0mL的供試品溶液中，旋渦混勻后，制得含有高、中、低濃度的三七總皂苷的供試品加樣回收溶液（外加對(duì)照品的濃度值為2078ng/mL、1039ng/mL、519ng/mL），每個(gè)濃度平行制備 6 份進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定供試品加樣回收溶液中五種皂苷的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出五種皂苷在加樣回收溶液中的含量（記錄為B濃度），B濃度與A濃度的差值即為實(shí)測(cè)的對(duì)照品濃度值。帶入按回收率公式：實(shí)測(cè)的對(duì)照品濃度值/外加對(duì)照品的濃度值×100%。計(jì)算五種皂苷的回收率。

2.5 樣品中五種皂苷成分含量測(cè)定 分別取“表1”中9個(gè)批次的血塞通注射液作為樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄五種皂苷的色譜峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中五種皂苷的成分的含量。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限和定量限標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以對(duì)照品進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制曲線并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。相關(guān)系數(shù)為 r>0.9988 ，線性關(guān)系良好，所得回歸方程、線性范圍、LOD 和 LOQ 見表4。

3.1.2 精密度、回收率和穩(wěn)定性 5 種皂苷的日內(nèi)精密度及日間精密度的 RSD 值分別小于 4.14%和 4.87%，說明方法精密度良好，詳見表5和表6。供試品溶液于4℃下保存，分別于0h、24h、48h 測(cè)定五種皂苷的濃度，結(jié)果顯示供試品溶液穩(wěn)定性較好，RSD≤7.32%，具體數(shù)據(jù)詳見表7。5 種皂苷低、中、高 3 種濃度的加樣回收率范圍為 94.02%～106.20%，表明方法回收率良好。

3.2 血塞通注射液樣品中的五種皂苷成分的含量測(cè)定9批血塞通注射液中的的五種皂苷成分的含量測(cè)定結(jié)果見表8。其中人參皂苷Rg1的含量范圍為28.39%～37.48%、人參皂苷Rb1的含量范圍為28.75%～43.01%、人參皂苷Rd的含量范圍為6.11%～11.53%、人參皂苷Re的含量范圍為2.945～6.10%、三七皂苷R1的含量范圍為5.82%～9.29%。由此可看出云南地產(chǎn)的，不同企業(yè)、不同批次的血塞通注射液中的五種皂苷成分的含量范圍跨度不大，且都符合現(xiàn)行血塞通注射液藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)“國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3590-2001（Z）-2011”的要求。來自同一生產(chǎn)企業(yè)的不同生產(chǎn)批號(hào)的血塞通注射液的五種皂苷成分的含量范圍差異較小，可見生產(chǎn)工藝都較為成熟穩(wěn)定。

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（收稿日期：2019-04-20 編輯：劉斌）