武開樂，庫西塔別克·買買提依不拉音，馬 靜，邵 偉,，余 雄

(l.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊830052；2.新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)重點(diǎn)試驗(yàn)室，烏魯木齊830052)

0 引 言

【研究意義】雌激素(estrogen，E)在哺乳動物的生理過程中發(fā)揮著重要作用，其具有抗氧化、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育等多種生理功能?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大多數(shù)雌激素對于哺乳動物的研究，都主要集中在對豬和羊繁殖性能的影響[1]，以及雌激素對奶牛泌乳性能[2-3]、乳成分[4]、抗氧化[5]及免疫功能[6]的調(diào)節(jié)上，奶牛乳腺上皮細(xì)胞是雌激素在奶牛乳腺中的重要反應(yīng)器，也是研究乳腺的生長發(fā)育和泌乳機(jī)制的重要體外模型。近年來，隨著激素對乳腺上皮細(xì)胞功能影響的研究逐漸深入，對于雌激素作用乳腺上皮細(xì)胞的機(jī)制也逐漸的展開了研究。雌激素主要是通過與乳腺組織中雌激素的特異性受體(estrogenreceptor, ER)的結(jié)合，調(diào)節(jié)乳腺導(dǎo)管和乳腺腺泡的發(fā)育[7]，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳腺上皮細(xì)胞的生長發(fā)育?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對奶牛乳腺上皮細(xì)胞的生長發(fā)育調(diào)控方面的研究卻少之又少。研究雌激素對乳腺上皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞生長周期變化規(guī)律的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，分析不同濃度雌激素對其生長發(fā)育的影響，為雌激素在細(xì)胞分子水平上調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2017年11月至2018年1月,在新疆肉乳用草食動物營養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行雌激素對乳腺上皮細(xì)胞的增殖及細(xì)胞生長周期規(guī)律影響的試驗(yàn)。

主要儀器為CO2恒溫培養(yǎng)箱、潔凈工作臺、生物倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、離心機(jī)、酶標(biāo)檢測儀、流式細(xì)胞儀。

主要試劑為乳腺上皮細(xì)胞：購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫、MEBM、胎牛血清(Fetal Bovine Serum/FBS)、核糖核酸酶RNase A、碘化丙啶 PI染液、胰酶Trypsin(Amresco)、PBS、CCK-8(Dojindo)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將乳腺上皮細(xì)胞復(fù)蘇后，添加細(xì)胞完全培養(yǎng)基，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)后，選取擴(kuò)增生長狀態(tài)良好的乳腺上皮細(xì)胞，添加0、50、100、200 μmol/L雌激素孵育BMECs后，分別在0、12、24、48、72 h后采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測各組細(xì)胞增殖情況，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期情況。

試驗(yàn)分為兩組：對照組為單純?nèi)橄偕掀ぜ?xì)胞培養(yǎng)組，試驗(yàn)組為不同濃度雌激素添加組。

1.2.2 細(xì)胞的復(fù)蘇及純化

將液氮罐中購買的細(xì)胞，用鑷子取出，迅速放在已開啟的37℃的水浴鍋中，不停地在水中晃動，使其在1 min內(nèi)融化。之后將其移至超凈臺內(nèi)，用移液槍接種至25 cm2(T25)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)基使其再次生長。在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)開始進(jìn)行擴(kuò)增純化。

1.2.3 細(xì)胞的培養(yǎng)

當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%左右之后，將舊的培養(yǎng)基棄去，用2～3 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗兩遍，加入預(yù)熱好的0.25%胰蛋白酶1～2 mL消化，在培養(yǎng)箱中孵育2～3 min，然后取出來在顯微鏡下一邊觀察一邊輕微地彈下培養(yǎng)瓶底部，讓其細(xì)胞脫落。在顯微鏡下觀察到大約70%細(xì)胞脫落之后，加入完全培養(yǎng)基終止消化。再用移液槍進(jìn)行輕微吹打?qū)⑵溆嗉?xì)胞吹打下來。移至離心管中，在2 000 r/min下離心2 min，小心棄去上清液，加入完全培養(yǎng)基并用移液槍打勻，傳到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，正常情況下3 d可以長滿培養(yǎng)瓶內(nèi)部，在此期間可以換一次培養(yǎng)基。按照上述的培養(yǎng)方法，將細(xì)胞純化擴(kuò)增到第3代，在加入不同濃度的雌激素，然后將所有細(xì)胞樣進(jìn)行12、24、48和72 h的培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8細(xì)胞

(1)細(xì)胞種板：將對數(shù)生長期細(xì)胞用胰蛋白酶消化，配制成細(xì)胞懸液，按3 000～5 000細(xì)胞每孔接種于96孔板，每孔加100 μL，置于CO2(5%)培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)過夜貼壁，邊緣孔用無菌PBS填充。

(2)按具體試驗(yàn)方案進(jìn)行藥物處理，每個(gè)樣本濃度設(shè)3～5個(gè)重復(fù)。

(3)CCK-8反應(yīng)：所有孔中分別加入10 μL CCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻，培養(yǎng)箱中孵育2 h。

(4)測吸光度值：使用酶標(biāo)儀測定450 nm光吸收值。

1.2.5 流式周期

(1)收集細(xì)胞：棄去上清，加入1 mL PBS清洗一次，棄上清，再加入1 mL 0.25%胰酶消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓且有部分細(xì)胞懸浮，即加入PBS終止消化。用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞懸浮。細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1 500 /min離心5 min收集細(xì)胞。

(2)PBS洗滌細(xì)胞：加入3 mL 4℃預(yù)冷的PBS完全重懸細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，棄上清。沉淀震蕩混勻。

(3)固定過夜：沉淀中緩慢加入-20℃預(yù)冷的75%乙醇，重懸細(xì)胞，4℃過夜。

(4)PBS洗滌細(xì)胞：加入2 mL PBS混勻后，1 500 /min離心5 min收集細(xì)胞，PBS重懸，離心收集細(xì)胞。加入100 μL PBS重懸細(xì)胞。

(5)去除RNA：加入2 μL濃度為1 mg/mL的RNaseA(去離子水配制)，37℃水浴40 min。

(6)熒光標(biāo)記：加入100 μL濃度為100 μg/mL 的PI染色液(PBS配制)，避光染色20 min。

(7)上機(jī)檢測：流式細(xì)胞儀使用激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波(長585±21 )nm進(jìn)行檢測，用Modfit 軟件分析細(xì)胞周期以確定細(xì)胞周期分布。

1.2.6 樣品收集

收集對照組及各雌激素濃度添加試驗(yàn)組在0、12、24、48、72 h各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞樣品，每組設(shè)3個(gè)平行，3個(gè)重復(fù)，取樣后將細(xì)胞樣品先放置于-20℃的冰箱中2 h，后取出放置于-80℃的冰箱過夜，再將過夜后的細(xì)胞樣品放入液氮罐中保存。試驗(yàn)結(jié)束后將樣品送至北京華英生物技術(shù)有限公司檢測細(xì)胞增殖及細(xì)胞生長周期。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有原始數(shù)據(jù)先用Excel 2016進(jìn)行整理，用SPSS 22軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)最終計(jì)算資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(X ±S)表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01作為差異極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀察奶牛乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)

2.1.1 復(fù)蘇后乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)

研究表明，復(fù)蘇后經(jīng)過傳代純化正常生長的奶牛乳腺上皮細(xì)胞分布均勻，細(xì)胞成片連接，呈鵝卵石樣平鋪瓶底。圖1

圖1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞復(fù)蘇后正常生長形態(tài)(200×)

Fig.1 Morphology of mammary epithelial cells in dairy cows after resuscitation(200×)

2.1.2 各試驗(yàn)組乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)

倒置顯微鏡下觀察到12 h時(shí)，50 μmol/L雌激素添加組的乳腺上皮細(xì)胞融合度最好(95%)，各試驗(yàn)組細(xì)胞成片連接，且呈鵝卵石樣生長(圖2)。24 h時(shí)，各試驗(yàn)組細(xì)胞體積變大，呈鵝卵石樣均勻鋪滿瓶底(圖3)。48 h時(shí)，各試驗(yàn)組細(xì)胞之間排列緊密，形成集落，聚集生長(圖4)。72 h時(shí)，各試驗(yàn)組細(xì)胞細(xì)胞生長減緩，細(xì)胞數(shù)量減少(圖5)。圖3～5

A：0 μmol/L雌激素添加組；B：50 μmol/L雌激素添加組；C：100 μmol/L雌激素添加組；D：200 μmol/L雌激素添加組

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

圖2 12 h時(shí)各試驗(yàn)組細(xì)胞生長形態(tài)(200×)

Fig.2 Growth morphology of cells in each experimental group at 12 h (200 ×)

A:0 μmol/L雌激素添加組；B:50 μmol/L雌激素添加組；C:100 μmol/L雌激素添加組；D:200 μmol/L雌激素添加組

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

圖3 24 h時(shí)各試驗(yàn)組細(xì)胞生長形態(tài)(200×)

Fig.3 Growth morphology of cells in each experimental group at 24 h (200 ×)

A:0 μmol/L雌激素添加組；B:50 μmol/L雌激素添加組；C:100 μmol/L雌激素添加組；D:200 μmol/L雌激素添加組

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

圖4 48 h時(shí)各試驗(yàn)組細(xì)胞生長形態(tài)(200×)

Fig.2 Growth morphology of cells in each experimental group at 48 h (200 ×)

A:0 μmol/L雌激素添加組；B:50 μmol/L雌激素添加組；C:100 μmol/L雌激素添加組；D:200 μmol/L雌激素添加組

A:0 μmol/L estrogen supplementation group; B:50 μmol/L estrogen supplementation group; C:100 μmol/L estrogen supplementation group; D:200 μmol/L estrogen supplementation group

圖 5 72 h時(shí)各試驗(yàn)組細(xì)胞生長形態(tài)(200×)

Fig.5 Growth morphology of cells in each experimental group at 72 h (200 ×)

2.2 細(xì)胞增殖

研究表明，對照組在不同雌激素濃度下細(xì)胞的OD值無明顯差異；培養(yǎng)12 h時(shí)，50 μmoL/L雌激素組的OD值顯著高于對照組及100 μmoL/L雌激素組(P<0.05)，且極顯著高于200 μmoL/L雌激素添加組(P<0.01)；培養(yǎng)24 h時(shí)，對照組OD值極顯著高于其他各濃度雌激素添加組(P<0.01)；培養(yǎng)48、72 h時(shí)，對照組OD值極顯著高于其他各濃度雌激素添加組(P<0.01)，且100 μmoL/L雌激素組極顯著高于200 μmoL/L雌激素添加組(P<0.01)。其余組間差異均不顯著。

在不添加雌激素時(shí)，對照組在48 h時(shí)OD值達(dá)到最高，極顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)(P<0.01)；添加50、100、200 μmoL/L雌激素時(shí)，12 h時(shí)的OD值極顯著高于其他各時(shí)間點(diǎn)(P<0.01)。其余組間差異均不顯著。表1

表1 不同雌激素濃度下不同時(shí)間段時(shí)對細(xì)胞增殖變化

Table 1 Effects of different estrogen concentrations on cell proliferation at different time points

項(xiàng)目Project時(shí)間Time (h)濃度(μmoL/L)Concentration01224487200.17±0.01Ga0.90±0.03Cb0.93±0.05Ca1.06±0.06Aa0.79±0.02Ea500.17±0.10Ga0.96±0.02Aa0.74±0.03Cc0.73±0.03Cc0.46±0.01Ec1000.18±0.10Ga0.87±0.03Ab0.73±0.04Cc0.75±0.05Cc0.44±0.01Ec2000.18±0.10Ga0.82±0.07Ac0.66±0.07Cc0.62±0.01Ce0.35±0.01Ee

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相鄰小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相隔小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；同行肩標(biāo)相鄰大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相隔大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

The adjacent lowercase letters of the same column data indicate significant difference (P<0.05), and the lowercase letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01); the adjacent uppercase letters of the shoulders indicate significant difference (P<0.05), which is separated by uppercase letters.The difference was extremely significant (P< 0.01)

2.3 細(xì)胞周期

研究表明，對照組在添加不同濃度雌激素時(shí)其G1、S、G2期無明顯差異；培養(yǎng)至12 h時(shí)，對照組及添加50 μmoL/L雌激素組其G1期極顯著高于其他兩組(P<0.01)，對照組S期極顯著高于其他各組(P<0.01)，添加100 μmoL/L雌激素組其G2期極顯著高于其他各組(P<0.01)；培養(yǎng)至24 h時(shí)，添加100、200 μmoL/L雌激素組G1期極顯著高于其他兩組(P<0.01)，添加50 μmoL/L雌激素組S期極顯著高于對照組及其他兩組(P<0.01)，對照組在G2期極顯著高于其他各組(P<0.01)；培養(yǎng)至48 h時(shí)，對照組在G1、G2期極顯著高于其他各組(P<0.01)，50、200 μmoL/L在S期極顯著高于對照組及其他組(P<0.01)；培養(yǎng)至72 h時(shí)，添加100 μmoL/L雌激素組其G1期極顯著高于對照組及其他各組(P<0.01)，對照組及添加50、200 μmoL/L雌激素組S期顯著高于添加100 μmoL/L雌激素組(P<0.05)，對照組在G2期極顯著高于其他各組(P<0.01)。其余組間差異均不顯著。

不添加雌激素時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)至48、72 h時(shí)其G1期極顯著高于對照組及其他各時(shí)間組(P<0.01)，24 h時(shí)其S、G2期極顯著高于對照組及其他各組(P<0.01)；在添加50 μmoL/L雌激素時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)至72 h時(shí)其G1期極顯著高于對照組及其他各時(shí)間組(P<0.01)，24 h時(shí)其S、G2期極顯著高于對照組及其他各組(P<0.01)；在添加100 μmoL/L雌激素時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)至72 h時(shí)其G1期極顯著高于對照組及其他各時(shí)間組(P<0.01)，24 h時(shí)其S期極顯著高于對照組及其他各組(P<0.01)，12、24 h時(shí)其G2期極顯著高于對照組及其他各組(P<0.01)。其余組間差異均不顯著。表2

表2 不同雌激素濃度下不同時(shí)間段時(shí)對細(xì)胞生長周期變化

Table 2 Effects of different estrogen concentrations on cell growth cycle at different time intervals

項(xiàng)目Project濃度(μmoL/L)Concentration時(shí)間(h)Time(h)012244872G1059.20±0.87Ca51.05±0.50Ea20.42±0.51Gb62.44±1.01Aa63.12±0.31Ad5059.63±0.84Ca51.10±0.03Ga19.44±0.26Ic53.89±0.16Ee67.59±1.09Ac10059.46±0.52Ca45.15±0.16Gb29.67±0.48Ia55.14±0.45Ece71.59±0.13Aa20059.64±0.32Ca44.64±0.12Gb30.29±0.60Ia56.65±1.34Ec69.01±0.01AbS019.82±0.29Ea32.73±1.08Ca45.48±0.08Ac19.87±0.86Ee20.11±1.69Eab5019.88±0.32Ga22.49±1.18Ee52.98±0.98Aa35.92±1.59Ca19.80±1.38Gab10019.65±0.40Ga24.77±0.10Ec39.65±2.66Ad29.80±0.41Cc18.87±0.08Gb20019.82±0.66Ga25.18±0.33Ec40.35±2.88Ad33.85±1.29Ca21.16±0.01GaG2020.97±0.68Ca16.21±1.58Ee34.10±0.42Aa17.68±0.14Ea16.77±1.38Ea5020.48±1.15Ea24.91±0.35Cc27.57±1.24Ac10.13±1.37Ge12.61±0.29Ic10020.88±0.91Ca30.07±0.05Aa30.66±2.17Ac15.05±0.04Ec9.54±0.21Ge20020.53±0.53Ca30.16±0.21Ac29.35±2.27Ab9.49±0.05Ee9.83±0.01Ee

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)相鄰小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相隔小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；同行肩標(biāo)相鄰大寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相隔大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

The adjacent lowercase letters of the same column data indicate significant difference (P<0.05), and the lowercase letters indicate that the difference is extremely significant (P<0.01); the adjacent uppercase letters of the shoulders indicate significant difference (P<0.05), which is separated by uppercase letters.The difference was extremely significant (P< 0.01)

3 討 論

3.1 雌激素對細(xì)胞增殖的影響

試驗(yàn)研究表明，添加雌激素與對照組相比可以促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖。乳腺上皮細(xì)胞是乳腺實(shí)質(zhì)的腺泡和導(dǎo)管系統(tǒng)的重要組成部分[8]，是研究乳腺生長發(fā)育和泌乳機(jī)制的重要體外模型。激素對乳腺上皮細(xì)胞功能影響的研究在近年來逐漸深入，雌激素可能通過自分泌或旁分泌的方式，誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞分泌其他生長因子[9-10]，然后進(jìn)入到血液中，發(fā)揮促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖的作用。研究表明雌激素可以促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖[11-12]。穆瑩等[13]的研究表明，與對照組相比，添加大豆異黃酮組奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖能力與活力顯著增強(qiáng)。劉春龍等[14]的研究表明,大豆異黃酮在一定濃度范圍內(nèi)有促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖及提高抗氧化水平的作用。與試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

低濃度50 μmoL/L雌激素具有促進(jìn)牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的作用，但在高濃度100 、200 μmoL/L雌激素環(huán)境下，細(xì)胞增殖的能力極顯著低于對照組?？赡苁谴罅康拇萍に嘏c其特異性受體發(fā)生了結(jié)合，使由旁分泌產(chǎn)生的生長因子大量的增加，出現(xiàn)了高濃度的雌激素抑制細(xì)胞增殖的現(xiàn)象。陳靜、Vandenberg、曹艷紅[15-17]等的研究表明，低濃度的雌激素能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，高濃度可以對奶牛乳腺上皮細(xì)胞造成損傷。

試驗(yàn)中，添加50 μmoL/L雌激素組在12 h時(shí)與對照組相比顯著促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖，而在24、48、72 h時(shí)與對照組相比極顯著的抑制了乳腺上皮細(xì)胞的增殖。可能的原因有兩種：一是可能因?yàn)槿橄偕掀ぜ?xì)胞在添加雌激素后，隨著培養(yǎng)的時(shí)間延長，其細(xì)胞自身分泌的雌激素量在逐漸的增加，雌激素的濃度變高，出現(xiàn)了高濃度雌激素抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖的現(xiàn)象；其二可能是因?yàn)橥ㄟ^旁分泌和自分泌形式產(chǎn)生的其他大量的生長因子和細(xì)胞的代謝物的不斷增加，消耗了細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，出現(xiàn)了這些生長因子、代謝物與乳腺上皮細(xì)胞競爭性抑制的現(xiàn)象，負(fù)向調(diào)節(jié)了雌激素促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖的作用。陳靜、Vandenberg[15-16]等的研究表明，乳腺上皮細(xì)胞的增殖作用與雌激素的添加劑量和作用時(shí)間的長短有關(guān)，與試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。

3.2 雌激素對細(xì)胞生長周期的影響

試驗(yàn)研究結(jié)果表明，添加雌激素后，乳腺上皮細(xì)胞在細(xì)胞生長各時(shí)期其基本的生長規(guī)律與對照組相一致，可能是因?yàn)槿橄偕掀ぜ?xì)胞自身的生長周期規(guī)律不受外界激素或其他生長因子等所影響。在整個(gè)細(xì)胞周期過程中，細(xì)胞都要經(jīng)歷由G1-S-G2-M期的歷程[18]。

在12 h時(shí)，各濃度雌激素添加組與對照組相比其細(xì)胞周期極顯著的由G1、S期轉(zhuǎn)向了G2期，G2期的細(xì)胞比例快速上升，大量的細(xì)胞停留在這個(gè)時(shí)期?？赡苁谴萍に氐奶砑蛹涌炝思?xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。陳秀霞等[19]研究發(fā)現(xiàn)雌、雄激素聯(lián)合作用還能促進(jìn)G2/M期細(xì)胞增多，可能是通過加快細(xì)胞周期進(jìn)程從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。

在12 h時(shí)，100、200 μmoL/L雌激素添加組G1期顯著高于50 μmoL/L雌激素添加組，S期、G2期極顯著高于50 μmoL/L雌激素添加組。說明高濃度的雌激素在一定的時(shí)間下可以加快細(xì)胞周期G1期向S、G2期的轉(zhuǎn)化。但此時(shí)各濃度雌激素通過復(fù)雜的信號系統(tǒng)對細(xì)胞周期的影響有待于進(jìn)一步深入研究。

試驗(yàn)中，在24、72 h時(shí)各濃度雌激素組的細(xì)胞生長周期相比于對照組顯著的阻滯在G1期，48 h時(shí)各濃度雌激素組的細(xì)胞生長周期相比于對照組極顯著的阻滯在S期?？赡茉蛴袃煞N，由于雌激素的濃度隨著時(shí)間的增加變高后，一是可能是高濃度雌激素通過誘導(dǎo)乳腺上皮凋亡并將細(xì)胞阻滯在G1期，使細(xì)胞不能進(jìn)入S期進(jìn)行DNA合成，最終使乳腺上皮細(xì)胞的體外增殖受到抑制；其二可能是細(xì)胞內(nèi)的DNA發(fā)生了損傷，細(xì)胞開始啟動損傷感應(yīng)機(jī)制[20-21]，使細(xì)胞的生長發(fā)生了阻滯，而后開始DNA修復(fù)，修復(fù)完成后的細(xì)胞方能進(jìn)入下一個(gè)周期，在此過程中，修復(fù)不成功的細(xì)胞則會出現(xiàn)凋亡。

4 結(jié) 論

添加雌激素可以促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖；且在50、100、200 μmoL/L這三種濃度的雌激素添加組中，50 μmoL/L雌激素添加組在12 h時(shí)促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖的效果最好，細(xì)胞的增殖情況比0 μmoL/L雌激素添加組增高了6.25%，其他各添加組在不同時(shí)間點(diǎn)均抑制了奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，且隨著濃度和時(shí)間的不斷增加，細(xì)胞的增殖能力不斷減弱。

添加雌激素不影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞在各時(shí)期時(shí)細(xì)胞生長的基本規(guī)律。在12 h時(shí)，各濃度雌激素添加組的細(xì)胞周期由G1、S期向G2期轉(zhuǎn)化較快，且100、200 μmoL/L高濃度雌激素添加組比50 μmoL/L低濃度雌激素添加組轉(zhuǎn)化較快；在24、48 h時(shí)，各濃度雌激素添加組的細(xì)胞周期被阻滯在S期；在72 h時(shí)，各濃度雌激素添加組的細(xì)胞周期被阻滯在G1期。