司民真 李倫 張川云 張德清 李家旺 楊永安

摘 ?要??將新鮮山柰、海南三七塊根的切片置于DXR 激光共焦顯微拉曼光譜儀下，用10倍物鏡觀察到山柰、海南三七的油細(xì)胞。將激光聚焦在油細(xì)胞上，獲得了山柰、海南三七油細(xì)胞中的精油拉曼光譜，不同油細(xì)胞上獲得的拉曼光譜非常相似。山柰的拉曼光譜與甲氧基肉桂酸乙酯的拉曼光譜，海南三七的拉曼光譜與苯甲酸芐脂的拉曼光譜在峰形、峰位上都非常相似。采用密度泛函理論（DFT）計算了甲氧基肉桂酸乙酯及苯甲酸芐脂拉曼光譜，計算的拉曼光譜與實驗的拉曼光譜非常相似，據(jù)此對甲氧基肉桂酸乙酯拉曼光譜和山柰油細(xì)胞中的精油拉曼光譜及苯甲酸芐脂拉曼光譜和海南三七油細(xì)胞中的精油拉曼光譜進(jìn)行了初步的歸屬，說明山柰的主要揮發(fā)物為甲氧基肉桂酸乙酯，海南三七的主要揮發(fā)物為苯甲酸芐脂。

關(guān)鍵詞 ?拉曼光譜;山柰油細(xì)胞;海南三七油細(xì)胞;甲氧基肉桂酸乙酯;苯甲酸芐脂中圖分類號??O657.37??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼??A

In Situ?Research on Fresh Kaempferia galanga?L. and Kaempferia rotunda?L. Oil Cells with Raman?Spectroscopy

SI Minzhen^1，2， LI Lun^1，2， ZHANG Chuanyun^1，2， ZHANG Deqing^1，2， LI Jiawang^1，2， YANG Yongan^1，2

1. Key Laboratory of Molecular Spectroscopy， Colleges and Universities in Yunnan Province， Chuxiong Normal University， Chuxiong， Yunnan 675000， China; 2. Application Institute of Spectroscopy Technology， Chuxiong Normal University， Chuxiong， Yunnan 675000， China

Abstract ?To identify the ingredient in the oil cells ofKaempferia galanga L.?andKaempferia rotunda L. at room temperature， and to avoid sample pretreatment and extractions which can be labor intensive， the work showed the possibility to detectin situthe main components of the essential oils in the two plants oil cells by Raman spectroscopy. Under the DXR laser confocal micro Raman spectrometer， the oil cells could be seen with objective lens of 10×. Different oil cells had similar Raman spectrum. The Raman spectrum of 4-methoxycinnamic acid ethyl ester and benzyl benzoate was obtained. The Raman spectrum of?K. galanga L.?was correlated very well with that of 4-methoxycinnamic acid ethyl ester， and that ofK. rotunda L. was correlated very well with that of benzyl benzoate. The Raman spectroscopy of 4-methoxycinnamic acid ethyl ester and benzyl benzoate was calculated by the density functional theory （DFT）. The Raman spectroscopic bands were assignment with the help of calculation. It indicated that the essential principal oil components ofK. galanga L. andK. rotunda L.?in the oil cells were 4-methoxycinnamic acid ethyl ester and benzyl benzoate.

Keywords ?Raman spectrum;Kaempferia galangaL.;Kaempferia rotundaL.; 4-methoxycinnamic acid ethyl?ester; benzyl benzoate

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.021

姜科（Zingiberaceae）山柰屬（Kaempferia L.）植物全世界有70種，我國有4種，即白花山柰（Kaempferia candida Wall.）、紫花山柰（Kaem pferia elegans （Wall.）?Bak.）、山柰（Kaempferia galanga L.）和海南三七（Kaempferia rotunda L.），其中山柰和海南三七在我國均有栽培，山柰根莖可作調(diào)香原料，海南三七花美麗、芳香^[1]。這2種植物均為姜科根香類香料植物，用水蒸氣蒸餾法從云南屏邊產(chǎn)山柰提取揮發(fā)油，通過氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對揮發(fā)油的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，其主要的揮發(fā)物為t-桂酸乙酯（31.95%）、t-對甲氧基桂酸乙酯（25.16%）、1-8桉葉油（8.27%），而西雙版納產(chǎn)海南三七的主要揮發(fā)物為苯甲酸芐酯（67.12%）、乙酸龍腦酯（10.95%）、樟腦（6.65%）^[2]。此外，陳福北等^[3]對廣西南寧產(chǎn)山柰鮮品用索氏法提取揮發(fā)油，通過氣-質(zhì)聯(lián)用對揮發(fā)油的主要化學(xué)成分進(jìn)行分析，主要揮發(fā)物為反式對甲氧基肉桂酸乙酯（72.56%）、反式肉桂酸乙酯（12.56%）、十五烷（6.38%）。佘金明等^[4]用水蒸氣蒸餾法從廣東產(chǎn)山柰中提取揮發(fā)油成分，通過氣-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對其分離檢測，其中主要化學(xué)成分為正十五烷（31.02%）、反式桂皮酸乙酯（23.49%）和對甲氧基肉桂酸乙酯（14.86%）。黎強等^[5]用頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分別對廣西、廣東及云南山柰中揮發(fā)性化學(xué)成分研究表明其主要揮發(fā)物為甲氧基肉桂酸乙酯（45.02%，41.8%，30.78%）、肉桂酸乙酯（17.18%，16.25%，15.66%）及十五烷（9.08%，8.04%，7.89%）。對海南三七揮發(fā)油的成分研究已有一些報道，Woerdenbag等^[6]采用水蒸氣蒸餾氣相色譜法對印尼產(chǎn)海南三七的塊莖揮發(fā)性成分進(jìn)行過研究，結(jié)果表明，其塊莖中主要揮發(fā)性成分為苯甲酸芐酯（benzyl benzoate，69.7%），正十五烷（n-pentadecane，22.9%）、茨烯（camphene，1.0%）。徐世濤等^[7]采用同時蒸餾萃取GC-MS聯(lián)用技術(shù)對云南西雙版納產(chǎn)的海南三七全株的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析研究，主要的成分為α-蒎烯（6.83%）、茨烯（13.00%）、β-蒎烯（18.97%）、茨酮（5.80%）?？梢?種植物都存在提取方法不同得到的主要揮發(fā)物不同的現(xiàn)象。由于測量揮發(fā)性物質(zhì)時使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，氣相色譜進(jìn)樣口溫度都在200?℃以上，這可能會引起待測物中熱不穩(wěn)定組分的變化。因此就需要1種不需要提取，即可在室溫下，快速獲取山柰及海南三七揮發(fā)油的主要成分的方法。

拉曼光譜早在1923年就被德國物理學(xué)家?Smekal所預(yù)言，且在1928年3月被印度物理學(xué)家Raman 在研究液體苯散射光譜的實驗中被觀察到。由于這項工作Raman于1930年獲得了物理學(xué)諾貝爾獎。任何2種不同的化合物均給出不同的拉曼譜圖，即各譜帶的波數(shù)和強度不同，由此可以對化合物進(jìn)行定性分析鑒定。不同化合物中同一基團或化學(xué)鍵又能給出波數(shù)相近的拉曼譜帶，借此又可進(jìn)行官能團的鑒別。拉曼光譜技術(shù)具有非破壞性，幾乎不需要樣品制備，可直接測定氣體、液體和固體樣品，并且不受水分子的干擾等優(yōu)點，因此被直接用于檢測新鮮植物中的油細(xì)胞。1999年，Kiefer首次報道采用顯微拉曼光譜/表面增強拉曼光譜技術(shù)對唇形科（Lami aceae）植物Thymus vulgaris和Origanum vulgaris油細(xì)胞內(nèi)的精油進(jìn)行原位成分分析^[8]，但其后卻鮮見這方面的報道。本文采用該方法對山柰及海南三七的油細(xì)胞內(nèi)的精油進(jìn)行研究，得出油細(xì)胞內(nèi)精油的主要成分。

1??材料與方法

1.1??材料

山柰塊根，2018年5月購于廣西茂名;海南三七塊根，2018年8月采集于西雙版納，并經(jīng)過專家鑒定。

甲氧基肉桂酸乙酯（4-Methoxycinnamic acid ethyl ester，Cas：1929-30-2）、苯甲酸芐酯（benzyl benzoate，Cas：120-54-1），購于Sigma公司。

DXR激光共聚焦顯微拉曼光譜儀，美國熱電公司，激發(fā)波長785 nm，物鏡、目鏡各為10×，激光功率15 MW。

1.2方法

2個植物樣品徒手切片后，制成水裝片待用。用Gaussian03 軟件中的RB3LYP（6-311G）及B3LYP/6-311+g（d，?p）方法對甲氧基肉桂酸乙酯、苯甲酸芐酯的拉曼光譜進(jìn)行了計算，并在Gaussian View中確認(rèn)振動模式。

2??結(jié)果與分析

2.1山柰

2.1.1??山柰不同油細(xì)胞的拉曼光譜??將激光聚焦在圖1所示油細(xì)胞上，得到圖2所示的拉曼光譜圖。圖2是不同油細(xì)胞上得到的拉曼光譜圖，拉曼光譜的峰形、峰位都非常相似，說明不同油細(xì)胞中得到的拉曼光譜具有較好的重復(fù)性及穩(wěn)定性，且不同油細(xì)胞中精油的主要揮發(fā)物的成分是一樣的。

是甲氧基肉桂酸乙酯和山柰油細(xì)胞的拉曼光譜圖。對比2者，其共有峰出現(xiàn)在1699/1707、1632/1634、1600/1604、1572/1576、1423/1422、1313/1313、1301/1302、1249/1249、1207/1204、1171/1171、1116/1112、883/881、865/865、846/849、779/778、636/637、550/553、380/376 cm^-1，共18條譜線（表1）。

2.1.3??甲氧基肉桂酸乙酯拉曼譜的計算及峰的歸屬??為了對甲氧基肉桂酸乙酯拉曼峰進(jìn)行初步的歸屬，用Gaussian03 軟件中的RB3LYP（6-311G）方法，對甲氧基肉桂酸乙酯的幾何結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，在優(yōu)化的基礎(chǔ)上計算了拉曼頻率。甲氧基肉桂酸乙酯的分子式及優(yōu)化的分子結(jié)構(gòu)見圖4。

圖5中a是甲氧基肉桂酸乙酯的實驗拉曼譜，b是用Gaussian03 軟件中的RB3LYP（6-311G）方法計算的拉曼譜，在1510～1800 cm^-1范圍內(nèi)乘以修正因子0.9752，在1000～1500 cm^-1范圍內(nèi)乘以修正因子0.9864，從圖中可見2者峰型、峰位和峰的相對強度都非常相似。根據(jù)峰位和峰的相對強度由計算的拉曼光譜對實驗的拉曼光譜進(jìn)行初步的歸屬，具體結(jié)果見表1。

以甲氧基肉桂酸乙酯、山柰油細(xì)胞為序?qū)ψV峰位置相近的峰進(jìn)行歸屬1699/1707 cm^-1（C=O伸縮振動）、1632/1634 cm^-1（C=C伸縮振動）、1600/1604 cm^-1（環(huán)的伸縮振動）、1572/1576 cm^-1（環(huán)的伸縮振動）、1423/1422 cm^-1（環(huán)的C-H搖擺振動）、1313/1313 cm^-1（C-H搖擺振動）、1301/1302 cm^-1（C-H搖擺振動）、1249/1249 cm^-1（11C-13O伸縮振動）、1207/1204 cm^-1（C-H搖擺振動）、1171/1171 cm^-1（C-H搖擺振動）、1116/1112 cm^-1（CH₃搖擺振動）、866/865 cm^-1（CH₃、C-O搖擺振動及環(huán)呼吸振動）、846/849 cm^-1（C-H搖擺振動）、779/778 cm^-1（環(huán)呼吸振動及6C-28C=26C彎曲振動）、636/637 cm^-1（環(huán)變形振動）、550/553cm^-1（環(huán)呼吸振動及3C-14O-15C彎曲振動）、380/376 cm^-1（13O-19C-22C彎曲振動）。從表1及以上的分析可見山柰的譜峰與甲氧基肉桂酸乙酯的譜峰有較好的對應(yīng)關(guān)系，在1800～300 cm^-1范圍內(nèi)甲氧基肉桂酸乙酯明顯的譜峰有18條，而山柰有18條譜峰與之對應(yīng)，對應(yīng)率為100%，且2者的峰位相比無明顯的移動，說明山柰油細(xì)胞中精油的主要成分為甲氧基肉桂酸乙酯。

2.2海南三七

圖6是海南三七的油細(xì)胞。將激光聚焦在該油細(xì)胞上，獲得油細(xì)胞的拉曼光譜，如圖7中a所示;圖7中b為苯甲酸芐脂的拉曼光譜。對比圖7的a和b，可見2者的峰強、峰位都非常的相似。圖7中c是用Gaussian03 軟件中的B3LYP/?6-311+g（d，?p）方法計算的苯甲酸芐脂的拉曼光譜，由計算拉曼光譜對實驗光譜及海南三七油細(xì)胞的拉曼光譜進(jìn)行初步歸屬，具體結(jié)果見表2。

圖8給出了苯甲酸芐脂的分子式及優(yōu)化的分子結(jié)構(gòu)。以苯甲酸芐脂、海南三七為序?qū)ψV峰位置相近的的峰進(jìn)行歸屬，1719/1721 cm^-1（C=O伸縮振動）、1602/1601、1452/1452 cm^-1（環(huán)的伸縮振動），1377/1376 cm^-1（C-H₂搖擺振動），1271/1272 cm^-1（環(huán)的變形振動及C-O、C-H搖擺振動），1213/1211 cm^-1（環(huán)呼吸振動及C-C伸縮振動），1178/1172、1160/1158、1030/1028、887/885 cm^-1（C-H搖擺振動），1004/1002 cm^-1（環(huán)呼吸振動），810/804 cm^-1（環(huán)呼吸振動及?C-H搖擺振動），675/674、619/617 cm^-1（環(huán)變形振動及C-H搖擺振動），199/197 cm^-1（蝶型振動）。由于海南三七的油細(xì)胞的拉曼光譜與苯甲酸芐脂的拉曼光譜無論峰形、峰位都一致，由此可判斷，海南三七的油細(xì)胞中的主要揮發(fā)物為苯甲酸芐脂。

3??討論

植物油細(xì)胞為一種異細(xì)胞，屬于分泌組織之一，是產(chǎn)生和儲存精油的主要場所^[9]，本文對山柰及海南三七油細(xì)胞內(nèi)精油的拉曼光譜研究表明，其主要的揮發(fā)物為甲氧基肉桂酸乙酯和苯甲酸芐脂。山柰主要揮發(fā)物為甲氧基肉桂酸乙酯，這與文獻(xiàn)[3]和文獻(xiàn)[5]的結(jié)論一致，對印度產(chǎn)的山柰^[10-11]和馬來西亞產(chǎn)的山柰^[12-13]研究發(fā)現(xiàn)，其主要揮發(fā)物也是甲氧基肉桂酸乙酯。山柰提取物中對甲氧基肉桂酸乙酯具有一定的防曬功效，可用于天然防曬化妝品的開發(fā)^[14]，對有翅桃蚜具有較強的驅(qū)避作用，可以減輕蚜蟲的危害，而且能夠抑制病毒病的發(fā)生^[15]，山柰揮發(fā)油可以影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡和周期，同時也能夠影響細(xì)胞內(nèi)蛋白和相關(guān)基因的表達(dá)^[16]。海南三七油細(xì)胞主要揮發(fā)物為苯甲酸芐脂這與文獻(xiàn)[2]和文獻(xiàn)[6]的研究結(jié)果一致，但Kumar^[17]采用水蒸氣蒸餾氣相色譜法得到印度產(chǎn)海南三七的塊莖揮發(fā)性成分主要為冰片（endo-borneol，9.30%）、dehydroisoandro sterone acetate（9.12%）和β-水芹烯（β-phellandr ene，7.08%;Hasnah^[18]用同樣方法得出印尼產(chǎn)海南三七主要揮發(fā)物是正十五烷（pentadecane，25.4%）、乙酸龍腦酯（bornyl acetate，24.9%）、苯甲酸芐酯（benzyl benzoate，15.3%）和樟腦（camphor，12.1%），與本文的結(jié)果不一致。本研究所采用油細(xì)胞原位拉曼光譜法，不需要提取，在常溫、常壓下就可獲得油細(xì)胞中精油的拉曼光譜，可避免對山柰、海南三七油揮發(fā)物質(zhì)中熱不穩(wěn)定組分的破壞。同時，原位拉曼測量所需樣品少，測量時間短，本研究可為培育高含量對甲氧基肉桂酸乙酯的山柰及高含量苯甲酸芐酯的海南三七提供技術(shù)支持。

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