占雷雷 朱國鵬 劉永華

摘 ?要??本研究以2個在可溶性糖和淀粉含量上存在顯著差異的鮮食型甘薯品種為材料，對其塊根中的可溶性糖（蔗糖、葡萄糖和果糖）和淀粉含量以及4種蔗糖分解酶的活性進(jìn)行測定與相關(guān)性分析，以明確調(diào)控甘薯塊根中可溶性糖和淀粉含量的關(guān)鍵蔗糖分解酶種類。結(jié)果表明：（1）明確甘薯塊根中活性最高的蔗糖分解酶為蔗糖合成酶（Sus），其次為細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶（CIN）和液泡轉(zhuǎn)化酶（VIN），細(xì)胞壁轉(zhuǎn)化酶（CWIN）的活性最低。（2）本研究表明，除了已報(bào)道的VIN外，CIN活性也和己糖含量之間呈顯著正相關(guān)，高己糖含量的甘薯品種塊根中具有更高的VIN和CIN活性;（3）甘薯塊根中Sus活性和淀粉含量之間呈極顯著正相關(guān)，高淀粉甘薯品種具有更高的Sus活性;（4）CWIN活性非常低，其在塊根發(fā)育中的具體作用有待進(jìn)一步深入研究。總之，蔗糖分解酶對甘薯品質(zhì)有重要影響，其中Sus是調(diào)控甘薯塊根淀粉含量的關(guān)鍵酶類，而CIN和VIN是調(diào)控塊根中己糖含量的關(guān)鍵酶類。

關(guān)鍵詞 ?甘薯;轉(zhuǎn)化酶;蔗糖合成酶;淀粉;己糖中圖分類號??S531??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼??A

Differential Roles of Four Sucrose-degrading Enzymes in the Formation of Qualities of the Storage Roots of Sweet Potato

ZHAN Leilei， ZHU Guopeng^*， LIU Yonghua^*

College of Horticulture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract ?The study was aimed to identify the sucrose-degrading enzymes playing key regulatory roles in the quality formation of sweet potato and the content of carbohydrates （i.e. sucrose， glucose， fructose and starch） in the storage roots of two sweet potato cultivars. The cultivars had large differences in carbohydrate content and enzyme activities. Sucrose synthase （Sus） activity was the highest among the four sucrose-degrading enzymes， followed by cytoplasmic invertase （CIN） and vacuolar invertase （VIN）. Cell wall invertase （CWIN） activity was the lowest. Besides VIN， it was found for the first time that there was also a significant positive correlation between CIN activity and hexose content. Cultivar with higher hexose content also had a higher CIN and VIN activity. There was a positive correlation between Sus activity and starch content. CWIN activity was the lowest among the four sucrose-degrading enzymes and its function in quality formation of storage root remained to be elucidated. Sus maight play key regulatory roles in starch accumulation of storage roots， whereas VIN and CIN play key regulatory roles in hexose accumulation.

Keywords ?sweet potato; invertase; sucrose synthase; starch; hexose

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.09.008

甘薯（Ipomoea batatasLam.）又名紅薯、地瓜等，在世界范圍內(nèi)均有廣泛栽培，是全球第七大農(nóng)作物^[1]。甘薯高產(chǎn)、耐瘠薄且營養(yǎng)豐富，不僅是重要的糧食作物^[2]，還是重要的工業(yè)原料、飼料、新型能源及保健作物^[3]。中國是世界上主要的甘薯生產(chǎn)國，2014年中國甘薯的栽培面積和產(chǎn)量分別占全球的42%和68%（FAO，2015），穩(wěn)居世界第一。隨著人們生活水平的不斷提高，我國甘薯消費(fèi)結(jié)構(gòu)正在向飼料比例減少、鮮食和食品加工比例增加的方向發(fā)展，人們對甘薯品質(zhì)的要求越來越高^[4]。其中，淀粉和可溶性糖含量是影響鮮食型甘薯品質(zhì)的重要因素。

雖然多年來我國在甘薯育種領(lǐng)域取得長足進(jìn)步，先后選育出多個不同用途的優(yōu)良甘薯品種，但在甘薯品質(zhì)方面和發(fā)達(dá)國家相比仍存在一定的差距。例如，與美國、日本等國相比，我國加工專用品種的淀粉含量相對較低，有很大的提升空間^[5]。此外，甘薯塊根中的可溶性糖含量受環(huán)境和栽培條件的影響，波動較大^[6-8]，如何選育出糖含量高且相對穩(wěn)定的優(yōu)良鮮食和食品加工專用甘薯品種需要進(jìn)行深入研究。

蔗糖分解代謝在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用，不僅可以為植物生長發(fā)育和干物質(zhì)積累提供碳骨架和能量，而且分解產(chǎn)生的己糖可以作為信號分子通過調(diào)控基因的表達(dá)來影響植物的生長發(fā)育進(jìn)程^[9]。植物體內(nèi)有兩種分解蔗糖的酶類：蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）和蔗糖合成酶（Sus）。Sus將蔗糖分解為UDP-葡萄糖和果糖，該反應(yīng)為可逆反應(yīng)^[10]。蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）則是將蔗糖分解為葡萄糖和果糖，該反應(yīng)為不可逆反應(yīng)。根據(jù)亞細(xì)胞定位的不同，轉(zhuǎn)化酶可進(jìn)一步分為細(xì)胞壁蔗糖轉(zhuǎn)化酶（CWIN）、液泡蔗糖轉(zhuǎn)化酶（VIN）和細(xì)胞質(zhì)蔗糖轉(zhuǎn)化酶（CIN）^[10]。大量的研究表明，不同的蔗糖分解酶在植物生長發(fā)育中發(fā)揮不同的作用。例如，Sus分解產(chǎn)生的己糖主要參與淀粉和纖維素的合成，CWIN主要調(diào)控蔗糖在植物體內(nèi)的運(yùn)輸和分配，VIN調(diào)控液泡中糖分的積累和細(xì)胞膨大，而CIN分解產(chǎn)生的己糖則用于呼吸作用，同時影響植物的抗氧化能力^[9]。

研究表明，蔗糖分解代謝在植物貯藏器官的可溶性糖和淀粉含量中起著決定性作用^[9]。例如，利用反義RNA技術(shù)下調(diào)馬鈴薯中Sus的表達(dá)會導(dǎo)致塊莖中淀粉含量的下降^[11-12]，而通過轉(zhuǎn)基因手段下調(diào)胡蘿卜中VIN的表達(dá)會降低肉質(zhì)根中己糖含量^[13]。在馬鈴薯中，下調(diào)VIN的活性會抑制低溫儲藏過程中發(fā)生的塊莖‘變甜現(xiàn)象，有效阻止后續(xù)食品加工過程中因?yàn)檫€原性己糖（如葡萄糖）含量過高而導(dǎo)致的‘褐變現(xiàn)象^[14-15]。

上述研究表明，蔗糖分解酶在馬鈴薯和胡蘿卜等塊根/塊莖作物的品質(zhì)形成中發(fā)揮著重要的作用。然而，到目前為止，國內(nèi)外的研究大多集中在對甘薯塊根中淀粉和糖分含量的研究上，尚不清楚蔗糖分解酶在甘薯塊根可溶性糖和淀粉含量調(diào)控中的具體作用。本項(xiàng)目以2個在可溶性糖和淀粉含量上存在顯著差異的甘薯品種為材料，對塊根中的4種蔗糖分解酶活性、可溶性糖和淀粉含量進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期初步鑒定出調(diào)控甘薯塊根中可溶性糖和淀粉含量的關(guān)鍵蔗糖分解酶類，為下一步通過常規(guī)育種手段或分子育種技術(shù)選育優(yōu)異甘薯新品種提供理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1材料

供試甘薯品種有2個，一個為江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的鮮食和淀粉加工兼用型品種‘蘇薯17，另一個為河南省商丘市農(nóng)林科學(xué)研究所選育的高淀粉品種‘商薯19，2個品種均為紅皮白肉品種。2個品種的生育期相似，介于140～150 d之間^[16-18]。同時，兩品種的表型性狀也十分相似，均表現(xiàn)為長紡錘形薯形，薯皮紅色，薯肉白色。

甘薯扦插苗取自海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院甘薯種質(zhì)資源苗圃。本研究在海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院農(nóng)科基地大棚內(nèi)進(jìn)行，試驗(yàn)時間為2017年11月17日至2018年3月17日。栽培基質(zhì)為蛭石、泥炭和田園土，混合比例為1∶1∶2?；|(zhì)容器選用塑料花盆，規(guī)格25 cm（直徑）×19 cm（高），每盆種植1株甘薯，常規(guī)水肥管理，吊蔓栽培。本研究共2個甘薯品種，每個品種4次重復(fù)，每個重復(fù)為1個植株（盆）。甘薯莖尖扦插后120 d時進(jìn)行取樣，將甘薯塊根挖出后洗凈擦干并取樣。取樣時每個重復(fù)從2個薯塊的中間位置準(zhǔn)確切取0.3 g樣品，于液氮中速凍后存放在–70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

甘薯塊根內(nèi)蔗糖、葡萄糖和果糖含量的測定參照Lunn等^[19]的酶學(xué)方法，以鮮重計(jì)。

淀粉含量的測定參照Smith等^[20]的酶學(xué)方法進(jìn)行，以鮮重計(jì)。

轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶活性的測定采用分光光度計(jì)方法，具體參照Tomlinson等^[21]的方法，2個酶活性單位均以每小時每克甘薯內(nèi)轉(zhuǎn)化成葡萄糖的微摩爾數(shù)表示，μmol/（h·g）。

1.3數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2003軟件進(jìn)行t-test分析。用SPSS 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，采用LSD法進(jìn)行顯著性分析。

2??結(jié)果與分析

2.1不同品種塊根中淀粉和可溶性糖含量的差異

對2個甘薯品種塊根中淀粉含量的測定表明，‘商薯19塊根中的淀粉含量顯著高于‘蘇薯17（圖1）。對塊根中可溶性糖（葡萄糖、果糖和蔗糖）含量的測定表明，甘薯塊根中的可溶性糖主要為蔗糖，而葡萄糖和果糖的含量相對較低，且葡萄糖和果糖含量之間差異不大（圖2A）。同時，不同品種在糖分相對組成上存在較大差異，‘商薯19塊根中的葡萄糖和果糖含量均顯著高于‘蘇薯17，但2個品種在蔗糖含量上差異不顯著（圖2A）。雖然‘商薯19塊根中的己糖（葡萄糖和果糖之和）含量顯著高于‘蘇薯17，但總可溶性糖（葡萄糖、果糖和蔗糖之和）含量在2個品種間并不存在顯著差異（圖2B）。因此在2個品種中，‘蘇薯17屬于低淀粉低己糖品種，而‘商薯19屬于高淀粉高己糖品種。

2.2不同品種塊根中蔗糖轉(zhuǎn)化酶和蔗糖合成酶活性的差異

對兩個甘薯品種塊根中3種蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性的測定表明，甘薯塊根中CIN活性最高，其次為VIN，而CWIN活性最低（圖3A），表明甘薯塊根中主要的蔗糖轉(zhuǎn)化酶為CIN和VIN。值得注意的是，2個品種在不同種類蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性上存在較大差異，具有高己糖含量的品種‘商薯19塊根中的CIN和VIN活性顯著高于低己糖含量的品種‘蘇薯17（圖3A）。與此相反，‘商薯19塊根中的CWIN活性則顯著低于‘蘇薯17。也就是說，塊根中高活性的CIN和VIN對應(yīng)著高含量的己糖。

前人的研究表明，Sus主要與植物儲藏器官中淀粉和纖維素的合成相關(guān)^[9]。上述數(shù)據(jù)表明2個甘薯品種在塊根淀粉含量上存在顯著差異，因此本研究對塊根中的Sus活性也進(jìn)行了測定。圖3B表明，甘薯塊根中的Sus活性非常高（‘商薯19和‘蘇薯17分別為25.4、61.1 μmol/（h·g））?，比塊根中主要轉(zhuǎn)化酶CIN的活性還高（‘商薯19和‘蘇薯17分別為15.7、25.0 μmol/（h·g）），因此Sus是甘薯塊根中分解蔗糖的主要酶類。更為重要的是，高淀粉型品種‘商薯19塊根中Sus活性顯著高于低淀粉型品種‘蘇薯17（圖3B）。

2.3塊根中蔗糖分解酶活性與己糖和淀粉含量之間的相關(guān)性分析

上述糖含量和酶活性的測定表明，塊根中高活性的Sus對應(yīng)著高含量的淀粉，而高活性的CIN和VIN對應(yīng)著高含量的己糖。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論是否正確，我們對來自2個甘薯品種的蔗糖分解酶（CWIN、VIN、CIN和Sus）活性與碳水化合物（淀粉、葡萄糖、果糖和蔗糖）含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明Sus活性和淀粉含量之間呈極顯著正相關(guān)（表1），而VIN、CIN活性和葡萄糖、果糖含量呈顯著正相關(guān)。

此外，值得注意的是，與CIN和VIN相反，CWIN活性與己糖（葡萄糖和果糖）含量之間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（表1）。

3??討論

可溶性糖和淀粉含量是決定鮮食型甘薯塊根品質(zhì)的兩個重要指標(biāo)，而蔗糖分解代謝在其中發(fā)揮著重要的作用^[22-24]。迄今為止，國內(nèi)外的研究大多集中在對甘薯塊根中淀粉和可溶性糖含量的研究，對塊根中蔗糖分解酶活性的研究比較少。因此，目前尚不清楚影響甘薯塊根可溶性糖和淀粉含量的關(guān)鍵蔗糖分解酶類是哪一種。本研究以2個在可溶性糖和淀粉含量上存在顯著差異的鮮食型甘薯品種為材料，對其塊根中的可溶性糖（蔗糖、葡萄糖和果糖）和淀粉含量以及4種蔗糖分解酶的活性進(jìn)行系統(tǒng)的研究，以期鑒定出調(diào)控甘薯塊根中可溶性糖和淀粉含量的關(guān)鍵蔗糖分解酶類，為優(yōu)質(zhì)甘薯新品種的選育提供理論依據(jù)。

本研究表明，2個甘薯品種塊根中主要的可溶性糖均為蔗糖，其次為果糖和葡萄糖（圖2A），這和前人在甘薯上的研究結(jié)果相一致^[23]。在蔗糖分解酶活性方面，Takahata等^[22]在1996年的研究表明，甘薯塊根中CIN活性比VIN高30%～50%，但該研究沒有同時測定Sus和CWIN活性，因此無法確定甘薯塊根中主要的蔗糖分解酶是哪一種。本研究對甘薯塊根中4種蔗糖分解酶活性進(jìn)行系統(tǒng)性的測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘薯塊根中Sus的活性最高，是主要的蔗糖分解酶類，其次為CIN和VIN，而CWIN活性最低（圖3）。

對‘商薯19和‘蘇薯17塊根中可溶性糖和淀粉含量的測定表明，雖然兩品種在總可溶性糖和蔗糖含量上不存在顯著差異（圖2），但兩者在己糖和淀粉含量上存在顯著差異（圖1和圖2），其中‘商薯19的淀粉和己糖含量均顯著高于‘蘇薯17。因此雖然2個品種同為高淀粉品種，但在海南的栽培環(huán)境下，‘商薯19具有更高的淀粉和己糖含量。

對‘商薯19和‘蘇薯17塊根中4種蔗糖分解酶活性的測定表明，兩者在這4種酶活性上也存在顯著差異。其中高淀粉品種‘商薯19比低淀粉品種‘蘇薯17具有更高的Sus活性（圖1和圖3）。甘薯塊根中主要的儲存物質(zhì)為淀粉。前人的研究表明，Sus的功能主要是促進(jìn)蠶豆^[25]和水稻^[26]等儲藏器官發(fā)育后期淀粉的合成。相關(guān)性分析也表明塊根淀粉含量與Sus活性之間呈極顯著正相關(guān)（表1），表明‘商薯19中高活性的Sus活性可促進(jìn)其塊根中淀粉的合成與積累。

轉(zhuǎn)化酶（VIN和CIN）可將蔗糖水解為果糖和葡萄糖^[6]，從而提高植物儲藏器官中的己糖（葡萄糖和果糖）含量^[14-15]。和‘蘇薯17相比，‘商薯19具有更高的VIN和CIN活性（圖3A），這可以解釋為什么‘商薯19塊根比‘蘇薯17塊根具有更高的己糖含量。對2個品種塊根中己糖含量與VIN活性以及CIN活性之間的相關(guān)性分析表明，塊根中的己糖含量與VIN和CIN活性之間均呈顯著正相關(guān)。前人的研究只是揭示出VIN與甘薯塊根中己糖含量呈正相關(guān)，但不清楚CIN對己糖含量的影響^[22]。CIN活性在大多數(shù)植物器官中非常低，例如番茄果實(shí)^[27]和豇豆種子^[28]。因此，和VIN相比，人們對CIN的研究較少，尚不明確其在植物中的具體功能。本研究不僅發(fā)現(xiàn)CIN在甘薯塊根中活性非常高，是甘薯塊根中主要的轉(zhuǎn)化酶種類，而且揭示出其活性和塊根己糖含量之間呈顯著正相關(guān)，是調(diào)節(jié)甘薯己糖含量的重要酶類。

需要特別指出的是，相關(guān)性分析表明，CWIN活性與塊根中己糖含量呈顯著負(fù)相關(guān)（表1），這與CIN和VIN上的研究結(jié)果正好相反，原因可能是由于CWIN在塊根中的活性相對較低，只有CIN或VIN活性的10%～25%左右，因此CWIN可能不是影響塊根己糖含量的主要轉(zhuǎn)化酶類。研究表明，CWIN在植物中的功能主要有2個。一是CWIN通過分解“庫”器官中的蔗糖，在光合葉片和“庫”之間形成一個從高到低的濃度梯度，從而促進(jìn)蔗糖向“庫”器官的轉(zhuǎn)運(yùn)^[9]。二是CWIN促進(jìn)蔗糖的“回收利用”，即CWIN可將從共質(zhì)體運(yùn)輸途徑中“泄露”出來的蔗糖分解為己糖（葡萄糖和果糖），然后這些己糖再被細(xì)胞膜上的己糖載體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中用于植物的生長發(fā)育^[29]。然而，有關(guān)CWIN在甘薯塊根發(fā)育中的具體生物學(xué)功能還有待于進(jìn)一步的研究和分析。

總之，本研究通過對2個甘薯品種塊根中淀粉和可溶性糖含量以及4種蔗糖分解酶活性的測定和比較分析，初步揭示：1）甘薯塊根中主要的蔗糖分解酶為Sus，其次為CIN和VIN，而CWIN活性最低。2）蔗糖分解酶對甘薯品質(zhì)有重要影響，其中Sus是調(diào)控甘薯塊根淀粉含量的關(guān)鍵酶類，而CIN和VIN是調(diào)控塊根中己糖含量的關(guān)鍵酶類。

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