宋志琴，王雪松，朱雅娟，朱海燕，張海榮

胚胎停育是指在妊娠早期胚胎發(fā)育至一個階段，由于受精卵缺陷、母體或外界等不利因素的影響而導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育，超聲檢查常表現(xiàn)為枯萎卵、胚芽無心管搏動，可發(fā)展為自然流產(chǎn)或稽留流產(chǎn)，發(fā)生率占臨床妊娠的15%～20%[1]。胚胎停育病因復(fù)雜，包括染色體異常、母體內(nèi)分泌失調(diào)、生殖道感染、母體生殖道異常、不健康的生活方式等[2]，其中環(huán)境因素和某些未知因素導(dǎo)致染色體畸變是其重要原因[3]。本研究通過對胚胎停育患者絨毛組織染色體核型分析，探討胚胎停育和染色體異常的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月—2014年3月中國人民解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心婦產(chǎn)科經(jīng)B超證實胚胎停止發(fā)育的孕婦168例，其中自然受孕流產(chǎn)樣本106例，輔助生殖受孕流產(chǎn)樣本62例。年齡(32.9±2.4)歲，孕齡7～12周。胚胎停止發(fā)育納入標(biāo)準(zhǔn):①有停經(jīng)史;②血尿人絨毛膜促性腺激素陽性;③B超檢查:宮腔內(nèi)有空孕囊或?qū)m腔內(nèi)可見胚芽或胚胎樣組織，未見胎心搏動，或曾檢測到胎心搏動之后消失。研究開展征得患者的知情同意并簽署知情同意書，同時經(jīng)過中心倫理委員會審查通過。

1.2 材料與試劑 Greiner Bio-One培養(yǎng)瓶(規(guī)格:25 cm2，尺寸:50 mL，德國)；離心機(jī)(型號：Thermo ST16R，德國)；CO2培養(yǎng)箱(型號：HERAcell 150i，德國)；顯微鏡(型號：OLYMPUS CK41，日本)；顯微鏡(型號：Leica Microsystems GSL120，德國)。完全培養(yǎng)基(Amnio MAX-Ⅱ 11269，美國GIBCO公司)，完全培養(yǎng)基(BIO-AMF-2，以色列BI公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%Trypsin-EDTA，美國GIBCO公司)；雙抗(Pen strep，美國GIBCO公司)。

1.3 方法

1.3.1 組織培養(yǎng)前處理 無菌條件下對患者進(jìn)行清宮手術(shù)，得到絨毛組織標(biāo)本。絨毛組織標(biāo)本于超凈工作臺中,用無菌生理鹽水洗滌3次(第1次加入10 000 U Pen strep雙抗0.5 mL)，去除紅細(xì)胞與蛻膜組織，在倒置顯微鏡下觀察，除去任何可疑的非絨毛組織,確認(rèn)所接種的組織為絨毛。每例10～30 mg，用眼科剪將絨毛組織剪成0.5～1 mm3小塊，直接加入5 mL培養(yǎng)液制備成細(xì)胞懸液，分別移入2個培養(yǎng)瓶，補充培養(yǎng)液至5 mL(在吸入細(xì)胞懸液時盡量避開大塊組織)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 種于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱；培養(yǎng)至第6天，顯微鏡下觀察，換新鮮培養(yǎng)液并傳代；以后每天觀察，可見較多梭形細(xì)胞聚集至少達(dá)5～6個細(xì)胞集落時，換液并繼續(xù)培養(yǎng)24 h收獲。

1.3.3 細(xì)胞收獲、玻片制備及染色體核型分析 收獲：秋水仙素終濃度為0.2 μg/mL,作用時間為4 h；以0.075% kcl低滲液37 ℃水浴處理5 min；3∶1固定液(甲醇∶冰醋酸)固定3次(預(yù)固定1次)。制片：取細(xì)胞固定液于每張玻片3～4滴，每個樣本滴3張玻片。75 ℃烤片3 h。常規(guī)G顯帶：0.25% Trypsin-EDTA胰蛋白酶消化數(shù)秒；過水清洗；晾干玻片；于pH 6.7磷酸緩沖鹽溶液稀釋Giemsa原液(1:10稀釋)進(jìn)行染色。染色體核型分析:將樣本于Leica Microsystems GSL120掃描，人工計數(shù)并進(jìn)行分析。每例計數(shù)20個中期分裂相，分析5個細(xì)胞核型。如遇嵌合型樣本加倍計數(shù)并分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件，計算胚胎停育異常染色體所占比率；2組間計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異比較具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胚胎停育絨毛組織染色體培養(yǎng)情況 共收集168例絨毛組織,2例存在污染,1例因絨毛壞死變性,細(xì)胞生長不佳導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，165例培養(yǎng)成功，培養(yǎng)成功率為98.21%。在培養(yǎng)成功的165例標(biāo)本中,檢出異常核型90例,異常檢出率為54.55%。異常核型中,常染色體三體48例,共涉及2、3、4、5、6、8、9、10、13、14、15、16、17、18、20、21、22號染色體，其中，16號染色體三體15例，占常染色體三體的31.25%(15/48)；常染色體單體1例；常染色體雙重三體3例；性染色體單體15例；性染色體多倍體20例；常染色體結(jié)構(gòu)異常3例。

2.2 低齡孕婦與高齡孕婦異常核型分布情況 165例培養(yǎng)成功樣本中，低齡孕婦126例，異常核型67例；高齡孕婦39例，異常核型23例；異常率分別是53.17%和58.97%，2組異常核型異常率差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.404,P>0.05)。但2組間異常染色體分布差異比較有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.236,P<0.05)，其中高齡孕婦異常核型主要為常染色體三體，異常核型常染色體三體22例，占比95.65%(22/23)；低齡孕婦異常核型常染色體三體28例，占比41.79%(28/67)；常染色體三體異常占比高齡孕婦與低齡孕婦差異比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.117,P<0.05)。表1。

表1 低齡孕婦與高齡孕婦異常核型分布情況[n(%)]

注：與低齡孕婦比較，*P<0.05

2.3 自然受孕與輔助生殖受孕流產(chǎn)標(biāo)本染色體異常情況 165例培養(yǎng)成功樣本中，自然受孕流產(chǎn)樣本103例，染色體異常58例，染色體異常率為56.31%；輔助生殖受孕流產(chǎn)樣本62例，染色體異常33例，染色體異常率為53.23%,2組染色體異常率差異比較無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.181,P>0.05)。

3 討論

鑒于早孕期胚胎停育的絨毛組織不同程度上存在變性壞死，本研究在胚胎停育絨毛組織的培養(yǎng)前處理過程中，沒有采用以往報道的膠原酶或胰酶處理方法[4-6]，而是采用機(jī)械剪碎法直接進(jìn)行絨毛細(xì)胞培養(yǎng)、制備染色體，培養(yǎng)成功率達(dá)98.21%(165/168)。證明該方法既操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定，又可以省去膠原酶或胰酶的高額費用，凡具有CO2培養(yǎng)箱的實驗室都可以進(jìn)行，有利于在基層醫(yī)院開展。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和胚胎停育是婦產(chǎn)科常見疾病，其中50%～60%的早期自然流產(chǎn)與胎兒的染色體異常有關(guān),也有報道認(rèn)為染色體異常的實際情況可能明顯高于這個比例,只是受常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)方法的局限影響了檢出率[7-9]。本研究培養(yǎng)成功的絨毛組織染色體核型分析中異常發(fā)生率為54.55%,包括多倍體、三體、單體以及結(jié)構(gòu)異常。其中，非整倍體核型占77.78%，常染色體三體占56.67%，是染色體數(shù)目異常的最主要表現(xiàn)形式，稍高于孫義錫等[10]研究中的41.58%。常染色體三體中，以16、20、21和22號染色體三體最多見，其中，16號染色體三體最多，約占常染色體三體的31.25%。分析原因為大多數(shù)染色體三體會在胚胎時期死亡，即使存活的病例中也會出現(xiàn)各種畸形、智力低下、生育力異常等表現(xiàn)。一般來說，常染色體異常比性染色體異常對基因組的組成以及胚胎的發(fā)育所造成的影響大很多。因16號染色體比20、21和22號染色體攜帶更多的基因，一旦出現(xiàn)16號染色體三體，胚胎常常在較早期就會停止發(fā)育而導(dǎo)致胚胎死亡，有人稱這種染色體是高度致死的三體。而部分20、21和22號染色體三體卻可以繼續(xù)發(fā)育甚至到足月兒分娩，所以在胚胎停育的流產(chǎn)中，常以16號染色體三體為多見。本研究中有12例三倍體，主要是由于雙雄或雙雌受精后，因有絲分裂分離失調(diào)而形成異常受精卵所致，多在胚胎期死亡而流產(chǎn)。通過流產(chǎn)絨毛組織染色體核型分析，可以明確胚胎遺傳物質(zhì)異常的類型，為遺傳咨詢提供準(zhǔn)確地分析依據(jù)，對幫助不良妊娠史夫婦建立自信并指導(dǎo)其再次妊娠有重要意義。

非整倍體大多由卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體不分離造成，即在減數(shù)分裂I期或減數(shù)分裂Ⅱ期成對的染色體不分離，孕婦年齡是明確的高危因素之一[11]。表1可見，本研究中高齡孕婦染色體異常率高于低齡孕婦，從異常核型分布看，高齡孕婦的異常核型主要為常染色體三體，占比95.65%(22/23)；低齡孕婦異常核型常染色體三體28例，占比41.79%(28/67)；但常染色體三體異常占比高齡孕婦與低齡孕婦差異比較具有統(tǒng)計學(xué)意義,與文獻(xiàn)報道相符[12-13]。提示年齡風(fēng)險作為高危因素應(yīng)該受到產(chǎn)科臨床的關(guān)注，在母嬰保健法中將年齡作為產(chǎn)前診斷的惟一風(fēng)險因素是非常重要的。

X染色體單體(Turner綜合征)在活產(chǎn)女嬰中的發(fā)生率為1/(2 500～3 000)，在早期自然流產(chǎn)中較為常見，占流產(chǎn)組織異常的20%，僅次于常染色體三體(50%～55%)，其發(fā)生的原因是性染色體不分離,但與母親年齡無關(guān)。研究證實，絕大多數(shù)單條的X染色體來源于母親，提示染色體不分離的事件發(fā)生于父方，與母親年齡無關(guān)[14]。本研究檢測到90例異常核型中，X單體核型15例，占總異常妊娠的16.67%；值得注意的是，15例X單體均發(fā)生在低齡孕婦中，占低齡孕婦異常妊娠的22.39%，也證明了與母親年齡無關(guān)。本研究在自然受孕與輔助生殖受孕流產(chǎn)標(biāo)本中，異常染色體率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與文獻(xiàn)報道一致[15]。

綜上所述,自然流產(chǎn)的發(fā)病率日趨升高，原因是多方面的，其主要原因為胚胎染色體異常。目前，由于操作難度大、成本高等原因，僅有少數(shù)實驗室能夠開展。隨著這一技術(shù)的不斷完善，操作難度及成本都在下降，基層醫(yī)院的普通臨床實驗室均可以開展。建議不孕不育門診或產(chǎn)科醫(yī)生提示自然流產(chǎn)夫婦進(jìn)行胚胎停育絨毛組織的染色體檢查，尋找胚胎停育病因，進(jìn)而明確胚胎遺傳物質(zhì)異常的類型，為遺傳咨詢提供依據(jù)。