李松磊　李倩如

【摘 要】目的：探究輔助性T（Thelper，Th）細(xì)胞22細(xì)胞在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）中的作用及其與Th17細(xì)胞之間的關(guān)系。方法：選擇2016年10月至2018年5月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的30例不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者為URSA組，選擇同期在本院行人流術(shù)的30例正常早孕婦女為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組孕婦外周血中Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞的數(shù)量，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)兩組孕婦血漿中白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-22和IL-17A的濃度的變化。結(jié)果：與對(duì)照組相比較，URSA組患者外周血中Th22細(xì)胞的數(shù)量和Th17細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，血漿中IL-22和IL-17A的濃度同樣顯著升高;在URSA組中，Th22細(xì)胞數(shù)量與Th17細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，而在對(duì)照組中，未見明顯相關(guān)性;在URSA組中，IL-22的濃度不僅與Th22細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，也與Th17細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，但與Th22細(xì)胞的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度較高。結(jié)論：Th22細(xì)胞的數(shù)量及其效應(yīng)因子IL-22濃度的顯著增高可能與URSA具有一定相關(guān)性，同時(shí)在URSA中，Th22細(xì)胞與Th17細(xì)胞呈相關(guān)，提示兩種細(xì)胞的分化成熟，可能相互影響。

【關(guān)鍵詞】T淋巴細(xì)胞;不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn);白細(xì)胞介素

Study on the roles of Th22 cells and cytokines in unexplained recurrent spontaneous abortion

Li Songlei1，2， Li Qianru*1

1.School of Basic Medical Sciences， Zhengzhou University， Zhengzhou， Henan 450000;

2.Department of Clinical Laboratory， the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou， Henan 450000

[Abstract] Objective：To investigate the role of Th22 cells in unexplained recurrent spontaneous abortion and its relationship with Th17 cells. Methods： Thirty women with unexplained recurrent spontaneous abortion in the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University from October 2016 to May 2018 were enrolled as URSA group. Thirty healthy pregnant women were selected as control group. Flow cytometry was used to detect the frequencies of Th22 cells and Th17 cells in the peripheral blood of the two groups. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the changes of IL-22 and IL-17A in the plasma of the two groups. Results： The percentages of Th22 and Th17 cells in peripheral blood of URSA patients were significantly increased than those in the control group， and the plasma concentrations of IL-22 and IL-17A of URSA patients were also significantly increased than those in the control group. There was a positive correlation between the Th22 and Th17 cells in the URSA group， but not in the control group. In the URSA group Positive correlation was found in the plasma concentration of IL-22 with Th22 cells， and also with Th17 cells. But the intensity of correlation with Th22 cells is relatively high. Conclusions： Increased frequencies of Th22 cells and high levels of IL-22 may be associated with USRA. And Th22 cells are correlated with Th17 cells， suggesting that the differentiation and maturation of the two cells may interact with each other.

[Key words]T-lymphocytes; Unexplained recurrent spontaneous abortion; Interleukins

自然流產(chǎn)是一種常見的妊娠期并發(fā)癥，影響著約50%～60%的正常妊娠，據(jù)估計(jì)，有1%～3%的女性在妊娠20周以前經(jīng)歷過(guò)3次或者3次以上的流產(chǎn)，這就被稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)[1]。目前研究認(rèn)為，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與染色體的異常、激素的異常分泌、子宮的畸形、感染、自身免疫性疾病等多種因素相關(guān)[2]。但是，以上機(jī)制僅能解釋少于50%的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，有大約60%復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的發(fā)生不能用上述機(jī)制進(jìn)行解釋，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）[3]。有資料顯示，在很大程度上，不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)與免疫系統(tǒng)的異常調(diào)控密切相關(guān)[4]。其中，CD4+T淋巴細(xì)胞各亞群介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因?qū)W中的作用是研究熱點(diǎn)之一[5]。

CD4+T淋巴細(xì)胞根據(jù)其轉(zhuǎn)錄因子和分泌的細(xì)胞因子的不同被分為Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Th22細(xì)胞、Th9細(xì)胞和Treg細(xì)胞[6]。已有研究證實(shí)，Th1細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間的免疫失衡，Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞之間的免疫失衡與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)密切相關(guān)[7-8]。Th22細(xì)胞是新近報(bào)道的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群，主要分泌細(xì)胞因子IL-22，不分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-17，是一種在功能上和基因表達(dá)上獨(dú)立的細(xì)胞亞群，在皮膚穩(wěn)態(tài)的維持、自身免疫性疾病、炎癥性疾病和癌癥等多種疾病的發(fā)病中的發(fā)揮關(guān)鍵作用[9-11]。然而，關(guān)于Th22細(xì)胞及其效應(yīng)細(xì)胞因子IL-22在生殖系統(tǒng)的研究甚少，故本研究通過(guò)檢測(cè)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者外周血中Th22細(xì)胞及Th17細(xì)胞的數(shù)量變化，以及血漿中細(xì)胞因子IL-22和IL-17A濃度的變化，初步探討Th22細(xì)胞在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中的作用及其與Th17細(xì)胞之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年10月至2018年5月在鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診就診的30例早期自然流產(chǎn)患者為URSA組，平均年齡為（29.00±2.45）歲，平均孕周為（8.69±1.22）周，以往均無(wú)活產(chǎn)史，B超未見胚胎心管搏動(dòng)，孕期未使用黃體酮等藥物治療。選擇同期在本院行人流術(shù)的正常早孕婦女30例為對(duì)照組，平均年齡為（26.16±3.14）歲，平均孕周為（9.12±1.09）周。URSA組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：1）有連續(xù)3次或3次以上的自然流產(chǎn)史;2）年齡小于40歲;3）夫婦雙方無(wú)染色體異常;4）性激素檢查，甲狀腺功能檢查，血糖，胰島素檢測(cè)及凝血功能檢測(cè)均正常;5）白帶常規(guī)、B超或子宮輸卵管造影等檢查排除生殖器官器質(zhì)性病變，解剖畸形以及感染因素;6）宮頸分泌物培養(yǎng)排除支原體，衣原體等感染;7）TORCH IgM檢查均為陰性;8）抗心磷脂抗體、抗子宮內(nèi)膜抗體、抗精子抗體、抗核抗體（ANA）、抗甲狀腺抗體（TPO-Ab、TG-Ab）等自身抗體均為陰性;9）男方精液分析正常;10）既往未接受過(guò)主動(dòng)免疫治療。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：以往無(wú)自然流產(chǎn)史、死胎、死產(chǎn)史，排除染色體及生殖器官解剖異常、內(nèi)分泌紊亂、自身免疫性疾病等疾病。有正常足月分娩一次以上。本次妊娠期間無(wú)腹痛及陰道出血，B超提示胚胎發(fā)育正常。研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書。兩組孕婦的年齡和孕周相比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可比較。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本的采集 兩組孕婦于入組時(shí)空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血4mL，置于肝素鈉抗凝管中，其中2mL全血用于流式細(xì)胞檢測(cè)，2mL分離血漿于-80℃保存用于細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血中Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例 取250μL肝素鈉抗凝全血，與250μL RPMI1640培養(yǎng)基（不含小牛血清）充分混勻后，加入1μL淋巴細(xì)胞刺激劑，于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)6h。培養(yǎng)后，取100μL細(xì)胞懸液，加入FITC標(biāo)記的抗人CD3和PerCP-Cy5.5標(biāo)記的抗人CD8a各5μL，室溫避光孵育30min，之后加入1mL溶血素，混勻后室溫避光10min，用PBS洗滌后加入1mL固定破膜劑，室溫避光孵育45min，加入破膜緩沖液洗滌2遍后，加入PE標(biāo)記的IL-22和APC標(biāo)記的IL-17A各5μl，室溫避光孵育30min，再加入破膜緩沖液洗滌2遍后，加入500μL染色緩沖液，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果用Flow Jo軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比表示。具體步驟如下：在淋巴細(xì)胞群中，以CD4設(shè)門，由于淋巴細(xì)胞刺激劑中佛波酯的作用會(huì)使淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志CD4發(fā)生內(nèi)吞效應(yīng)，因此本研究利用CD3和CD8a反設(shè)門CD4，之后再以IL-22和IL-17A的同型對(duì)照進(jìn)行設(shè)門，將Th22細(xì)胞表示為CD3+CD8a-IL-17A-IL-22+細(xì)胞，將Th17細(xì)胞表示為CD3+CD8a-IL-17A+細(xì)胞。流式抗體、淋巴細(xì)胞刺激劑和固定破膜劑均購(gòu)自美國(guó)eBioscoence公司。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定血漿中細(xì)胞因子IL-22和IL-17A的濃度 嚴(yán)格按照說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作，以吸光度（A）為橫坐標(biāo)，以濃度遞增的標(biāo)準(zhǔn)品為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（±s）表示，組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)性分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 URSA組與對(duì)照組孕婦外周血中Th22細(xì)胞、Th17細(xì)胞以及CD4+IL17A+IL-22+雙陽(yáng)性T細(xì)胞數(shù)量的比較

URSA組孕婦外周血中Th22細(xì)胞、Th17細(xì)胞和CD4+IL17A+IL-22+雙陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1，圖1。

圖1 兩組孕婦外周血中Th22細(xì)胞、Th17細(xì)胞及CD4+IL17A+IL-22+雙陽(yáng)性T細(xì)胞占CD4+T淋巴細(xì)胞百分比的流式分析圖

2.2 URSA組與對(duì)照組孕婦血漿中細(xì)胞因子IL-22和IL-17A濃度的比較

URSA組孕婦血漿中細(xì)胞因子IL-22和IL-17A的濃度顯著高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 URSA組和對(duì)照組孕婦外周血中Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞的相關(guān)性分析

在URSA組中，Th22細(xì)胞的數(shù)量與Th17細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)（r=0.690，P=0.000），而在對(duì)照組中，Th22細(xì)胞的數(shù)量和Th17細(xì)胞的數(shù)量無(wú)相關(guān)性（r=0.269，P=0.204）。

2.4 URSA組中細(xì)胞因子IL-22與Th22細(xì)胞、Th17細(xì)胞的關(guān)系

在URSA組中，血漿中IL-22的濃度與Th22細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)（r=0.590，P=0.002），同時(shí)與Th17細(xì)胞的數(shù)量也呈正相關(guān)（r=0.401，P=0.047）。

3 討論

從免疫學(xué)的觀點(diǎn)來(lái)看，在人類妊娠中，胎兒攜帶有父源性基因和抗原，這對(duì)母體免疫系統(tǒng)來(lái)說(shuō)是一種半同種異體移植物，因此，正常妊娠的維持必定需要一種保護(hù)機(jī)制來(lái)避免母體免疫系統(tǒng)對(duì)胎兒發(fā)生排斥反應(yīng)[12]。一旦這種免疫耐受的保護(hù)機(jī)制被打破，就會(huì)引發(fā)病理性妊娠，復(fù)發(fā)性流產(chǎn)就是一種常見的病理性妊娠。在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)中，URSA占半數(shù)以上，然而，該種疾病的發(fā)病原因不可得知，因此在該病的治療和預(yù)防上存在較大的難度[13]。有資料顯示，免疫系統(tǒng)的調(diào)控異常與URSA的發(fā)生密切相關(guān)，CD4+T淋巴細(xì)胞之間的異常作用和細(xì)胞因子的分泌紊亂是一個(gè)關(guān)鍵因素[5]。研究表明，Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞之間的免疫失衡與Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞之間的免疫失衡在URSA中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14]。本研究重點(diǎn)關(guān)注于新近發(fā)現(xiàn)的CD4+T淋巴細(xì)胞亞群Th22細(xì)胞，初步探討Th22細(xì)胞與URSA的關(guān)系，以及在URSA中其與Th17細(xì)胞的關(guān)系。

Th22細(xì)胞是Eyerich S等研究者在2009年首次報(bào)道的一種新穎的Th細(xì)胞亞群，該細(xì)胞主要分泌IL-22，但不分泌IFN-γ，IL-4和IL-17，是一種有別于Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞和Th17細(xì)胞的細(xì)胞群體[9]。IL-22是Th22細(xì)胞的主要效應(yīng)分子，IL-22通過(guò)與其廣泛分布于細(xì)胞、組織和器官中的IL-22受體相互作用，在不同的微環(huán)境中執(zhí)行不同的功能[15]。最近的研究證明，滋養(yǎng)細(xì)胞上存在IL-22的受體，并且IL-22和其受體結(jié)合后可對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用，即可促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、延長(zhǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞的生存時(shí)間并抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡[16-17]。到目前為止，關(guān)于Th22細(xì)胞和IL-22與URSA的關(guān)系的報(bào)道甚少，為了探究Th22細(xì)胞與URSA的關(guān)系，筆者通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了URSA組和對(duì)照組孕婦外周血中Th22細(xì)胞的數(shù)量，在URSA組中我們觀察到數(shù)量顯著增多的Th22細(xì)胞，在外周血中同樣檢測(cè)到濃度升高的IL-22，因此，筆者推測(cè)外周血中數(shù)量增多的Th22細(xì)胞可能與URSA具有一定相關(guān)性。但是，Th22細(xì)胞和細(xì)胞因子IL-22在不同的細(xì)胞、組織和器官中具有雙重調(diào)控作用。研究表明，IL-22可在多種組織中發(fā)揮免疫保護(hù)的作用，它可以通過(guò)誘導(dǎo)皮膚防御素、鈣粒蛋白-A和鈣粒蛋白-B的表達(dá)增加皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的抗菌能力，同時(shí)在病毒性肝炎中可保護(hù)肝臟細(xì)胞并修復(fù)肝損傷，此外，在潰瘍性結(jié)腸炎中，能夠加速創(chuàng)面的愈合，發(fā)揮保護(hù)創(chuàng)面的功能[18-20]。然而，Th22細(xì)胞和IL-22并非只發(fā)揮免疫保護(hù)的功能，研究發(fā)現(xiàn)其與多種自身免疫性疾病、炎癥性疾病和癌癥的發(fā)病密切相關(guān)[21-22]。有資料顯示，IL-22作為促炎性細(xì)胞因子參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病，并且疾病的嚴(yán)重程度與Th22細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)[23]。因此，考慮到Th22細(xì)胞和IL-22作用的復(fù)雜性，本研究?jī)H僅初步觀察到了在URSA中，Th22細(xì)胞的數(shù)量是增多的，至于增多的Th22細(xì)胞在URSA中如何發(fā)揮作用，仍需深入研究。

關(guān)于Th17細(xì)胞與URSA關(guān)系的報(bào)道較多，目前較多的研究認(rèn)為在URSA患者外周血中和蛻膜中Th17細(xì)胞的數(shù)量是增多，這與本研究中在URSA患者外周血中所觀察到的結(jié)果是一致的。Th17細(xì)胞數(shù)量的增多，其所分泌的細(xì)胞因子IL-17A增多，IL-17A作用廣泛，可以誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子（IL-23、IL-6、TNF-α）和多種趨化因子（巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1、巨噬細(xì)胞炎性趨化因子-2、基質(zhì)金屬蛋白酶等），這些效應(yīng)因子可進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)組織浸潤(rùn)和組織損傷，從而不利于妊娠的維持[24-25]。此外，本研究重點(diǎn)分析了Th22細(xì)胞與Th17細(xì)胞的關(guān)系，以往的研究表明，Th22細(xì)胞與Th17細(xì)胞關(guān)系密切，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、宮頸癌和再生障礙性貧血等多種疾病中相互影響，表現(xiàn)為共同的變化趨勢(shì)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，Th22細(xì)胞與Th17細(xì)胞的數(shù)量均增多，且兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系，同時(shí)Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子RORγt可調(diào)控Th22細(xì)胞的分化[23，26-27]。在本研究中，筆者應(yīng)用了pearson相關(guān)分析法分析了兩組孕婦外周血中Th22細(xì)胞與Th17細(xì)胞的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在URSA組中，Th22細(xì)胞的數(shù)量與Th17細(xì)胞的數(shù)量呈明顯的正相關(guān)，而在對(duì)照組中，則沒有觀察到顯著的相關(guān)性，因此，筆者推測(cè)在URSA中，Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化成熟，可能相互影響，具有共同的驅(qū)動(dòng)方式。

IL-22是IL-10細(xì)胞因子家族中的一員，主要由活化后的T細(xì)胞分泌，Th22細(xì)胞、Th17細(xì)胞、Th1細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞都可分泌IL-22[28]。有資料顯示，在所有分泌IL-22的細(xì)胞中，Th22細(xì)胞所占的比例最大，為37%～63%，Th17細(xì)胞所占的比例是10%～18%[9]。由此可見，Th22細(xì)胞是主要分泌IL-22的細(xì)胞群體，這就為本研究中觀察到URSA患者外周血中的IL-22的濃度與Th22細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)提供了支持，由此推測(cè)濃度升高的IL-22可能主要來(lái)源于Th22細(xì)胞。然而，在URSA組中，IL-22的濃度不僅與Th22細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，也與Th17細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)，但與Th22細(xì)胞的關(guān)聯(lián)系數(shù)較大，關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)，同時(shí)，在URSA組中CD4+IL-17A+IL-22+雙陽(yáng)性細(xì)胞（分泌IL-22的Th17細(xì)胞）的數(shù)量較對(duì)照組顯著增多，雖然這一細(xì)胞群體所占的比例很少，但是這足以說(shuō)明，在URSA中，除Th22細(xì)胞之外，濃度增多的IL-22可能同時(shí)來(lái)源于Th17細(xì)胞，只是Th17細(xì)胞所占的比例很小。然而，IL-22與Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞的關(guān)系不僅僅限于此，我們?nèi)匀恍枰M(jìn)一步去探究IL-22如何在URSA中發(fā)揮作用，以及其與其他細(xì)胞和細(xì)胞因子之間的關(guān)系。

綜上所述，Th22細(xì)胞的數(shù)量及其效應(yīng)因子IL-22濃度的顯著增高可能與URSA具有一定相關(guān)性，同時(shí)Th22細(xì)胞與Th17細(xì)胞呈相關(guān)，提示兩種細(xì)胞的分化成熟，可能相互影響，具有共同的驅(qū)動(dòng)方式。此外，在URSA中，IL-22可能同時(shí)來(lái)源于Th22細(xì)胞和Th17細(xì)胞，但究竟IL-22是如何發(fā)揮作用的，以及其與兩種細(xì)胞之間的潛在關(guān)系，仍需要深入探究。

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