邵 晨，趙龍冬，孫立杰，孫 杰，王苗苗，張保華

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)新農(nóng)藥創(chuàng)制研究所，山東青島 266109）

隨著社會對環(huán)境的日益重視，乳油、粉劑等傳統(tǒng)農(nóng)藥劑型的環(huán)境污染問題備受關(guān)注，水乳劑（EW）作為一種不用或很少用有機溶劑的水性化制劑，具有綠色、環(huán)保、安全的優(yōu)點，已經(jīng)成為代替?zhèn)鹘y(tǒng)劑型產(chǎn)品尤其是乳油產(chǎn)品的主要環(huán)保劑型[1-3]。

植物源農(nóng)藥是目前一類重要的生物農(nóng)藥，主要是利用植物的次生代謝產(chǎn)物對農(nóng)業(yè)病蟲草害進行防治[4-5]。大蒜素是從大蒜的球形鱗莖中提取的一種具有揮發(fā)性的黃色油狀物，主要成分是二烯丙基硫代亞磺酸酯。已有研究表明大蒜素對多種細菌、真菌和病毒有良好的抑制效果[6-8]。丁香酚是一種來源于丁香等植物的具有丁香香氣的酚類化合物，具有抑菌、抗病毒、保鮮和增強植物抗凍性等作用[9-12]。目前，大蒜素和丁香酚均被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

基于大蒜素與丁香酚的環(huán)境友好性和廣泛抑菌活性，本研究以大蒜素和丁香酚作為有效成分，結(jié)合水乳劑的配方優(yōu)化，確定了20%大蒜素·丁香酚水乳劑的穩(wěn)定配方，并以灰葡萄孢菌為供試菌株測定其室內(nèi)生物活性，以期為20%大蒜素·丁香酚水乳劑的進一步開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

原藥與制劑：大蒜素（98.5%），深圳市鼎誠植物香料有限公司；丁香酚（化學(xué)純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；250 g/L吡唑醚菌酯乳油，巴斯夫植物保護（江蘇）有限公司。助劑：主要有苯乙基苯酚聚氧乙烯聚氧丙烯醚（乳化劑33#），邢臺鑫藍星科技有限公司；蓖麻油聚氧乙烯醚（By-125），上海忠誠精細化工有限公司；聚醚磷酸酯類表面活性劑WJ-630、WJ-990，上海萬金助劑有限公司。結(jié)構(gòu)調(diào)整劑：氯化鈉、尿素、硅酸鎂鋁、聚乙二醇400、聚乙二醇600。防凍劑：乙二醇、丙三醇、1,2-丙二醇。供試病原菌：灰葡萄孢菌。

BME型密閉式實驗室乳化剪切機，上海德雨機電設(shè)備有限公司；JA5003N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BT-9300H型激光粒度分布儀，丹東百特儀器分析公司；三門電冰箱，青島海爾股份有限公司；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，龍口市先科儀器有限公司；紫外分光光度檢測儀，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 20%大蒜素·丁香酚水乳劑的制備

采用轉(zhuǎn)相法制備20%大蒜素·丁香酚水乳劑。稱取一定量的大蒜素與丁香酚，加入一定量乳化劑后，混合攪拌形成油相，將結(jié)構(gòu)調(diào)整劑、防凍劑等助劑與蒸餾水混合形成水相。在高速剪切的過程中，將水相加入到油相中，充分混合，在3 500 r/min的剪切速度下剪切5 min，自發(fā)形成油包水型體系。

1.2.2 指標(biāo)測定方法

按照《農(nóng)藥熱貯穩(wěn)定性測定方法》（GB/T 19136—2003）測定20%大蒜素·丁香酚水乳劑在（54±2）℃條件下貯存7 d的穩(wěn)定性。按照《農(nóng)藥低溫穩(wěn)定性測定方法》（GB/T 19137—2003）測定冷貯穩(wěn)定性。按照《農(nóng)藥乳液穩(wěn)定性測定方法》（GB/T 1603—2001）測定乳液穩(wěn)定性。

1.2.3 粒徑測定方法

20%大蒜素·丁香酚水乳劑的粒徑利用激光粒度分布儀測定，平行測定3次后取其平均值。

1.2.4 有效成分含量測定方法

參考文獻[13]的方法，將20%大蒜素·丁香酚水乳劑、大蒜素標(biāo)準(zhǔn)品、丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品分別用無水乙醇溶解稀釋，用紫外分光光度計在200～400 nm對大蒜素、丁香酚的標(biāo)準(zhǔn)品進行光譜掃描，得到兩種有效成分的最大吸收波長。在其最大吸收波長下，分別測定不同稀釋濃度的大蒜素、丁香酚的吸光度，得到大蒜素、丁香酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.139 6 x＋0.364（R2=0.9937）；y=0.0197x＋0.0263（R2=0.9928）。分別在兩個吸收波長下，測定20%大蒜素·丁香酚水乳劑的吸光度，計算制劑中有效成分大蒜素、丁香酚的含量。

1.2.5 生物活性測定方法

以灰葡萄孢菌為供試菌，采用生長速率法測定20%大蒜素·丁香酚水乳劑對供試菌株的室內(nèi)生物活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳化劑的篩選

2.1.1 單一乳化劑的篩選結(jié)果

水乳劑中的乳化劑可使油水的界面張力和表面自由能降低，而且乳化劑具有空間位阻作用和靜電作用，促使乳液體系更加穩(wěn)定[14]。5種單一乳化劑對20%大蒜素·丁香酚水乳劑各項性能的影響見表1。乳化劑加入量為5%。

表1 5種單一乳化劑對20%大蒜素·丁香酚水乳劑各項性能的影響

結(jié)果顯示，在5種備選乳化劑中，WJ-630、WJ-990各項性能相對較好，常溫放置一段時間無油滴析出，熱貯有少量析水分層。這兩種乳化劑的D10值、D50值和D90值較小（圖1）。因此，選擇WJ-630、WJ-990兩種乳化劑用于復(fù)配乳化劑的篩選優(yōu)化。

圖1 5種乳化劑對20%大蒜素·丁香酚水乳劑粒徑的影響

2.1.2 復(fù)配乳化劑的篩選結(jié)果

不同的乳化劑具有不同的親水親油特性，通過乳化劑復(fù)配可以實現(xiàn)乳化劑的協(xié)同作用，提高水乳劑的各項性能和制劑的穩(wěn)定性。結(jié)合以上對單一乳化劑的篩選結(jié)果，將WJ-630、WJ-990兩種乳化劑按不同質(zhì)量比例復(fù)配，總用量為5%。結(jié)果見表2和圖2。

結(jié)果顯示，兩種乳化劑復(fù)配后對水乳劑體系的穩(wěn)定性均有影響。在不同復(fù)配比例中，當(dāng)WJ-630和WJ-990的質(zhì)量比為4∶1時，水乳劑各項性能指標(biāo)較好，具有較小的粒徑和粒度范圍。但此配方長時間貯存后仍有微量水析出，需要加入結(jié)構(gòu)調(diào)整劑改善水乳劑的穩(wěn)定性。

表2 乳化劑質(zhì)量比的篩選

圖2 乳化劑的不同質(zhì)量比對水乳劑粒徑的影響

2.2 結(jié)構(gòu)調(diào)整劑的篩選

結(jié)構(gòu)調(diào)整劑可以通過調(diào)節(jié)體系黏度、多相的密度差等方式，降低分散相微粒的沉降聚結(jié)速度，提高水乳劑體系的穩(wěn)定性。在對乳化劑篩選的基礎(chǔ)上，選擇幾種結(jié)構(gòu)調(diào)整劑進一步改善水乳劑的各項性能，結(jié)果見表3和圖3。結(jié)構(gòu)調(diào)整劑加入量為3%。

表3 結(jié)構(gòu)調(diào)整劑的篩選結(jié)果

圖3 結(jié)構(gòu)調(diào)整劑對水乳劑粒徑的影響

結(jié)果顯示，不同結(jié)構(gòu)調(diào)整劑對水乳劑的外觀影響不大，均能達到合格，但乳液穩(wěn)定性存在差異。綜合各項性能測定結(jié)果，加入聚乙二醇400的水乳劑體系具有良好的穩(wěn)定性，且其能夠使水乳劑體系保持較小的粒徑和較窄的粒度范圍。因此，選擇聚乙二醇400作為水乳劑的結(jié)構(gòu)調(diào)整劑。

2.3 防凍劑的篩選結(jié)果

水乳劑作為一種油水分散體系，在低溫條件下易冷凍結(jié)冰，防凍劑的加入可以保障其在低溫下依然保持良好的流動性，使水乳劑在低溫時保持良好穩(wěn)定性。經(jīng)過對4種防凍劑的篩選，發(fā)現(xiàn)加入3%乙二醇時，水乳劑乳液穩(wěn)定性、分散性等性能表現(xiàn)良好。

2.4 配方的確定及性能測定

經(jīng)過篩選，確定20%大蒜素·丁香酚水乳劑的優(yōu)化配方為：大蒜素5%、丁香酚15%、WJ-630 4%、WJ-990 1%、聚乙二醇400 3%、乙二醇3%，用去離子水補足至100%。所制水乳劑產(chǎn)品指標(biāo)檢測結(jié)果見表4，均達到產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求。

表4 20%大蒜素·丁香酚水乳劑指標(biāo)檢測結(jié)果

2.5 生物活性測定結(jié)果

以灰葡萄孢菌作為供試菌，25%吡唑醚菌酯乳油作為對照藥劑，測定20%大蒜素·丁香酚水乳劑的室內(nèi)抑菌活性。通過表5可以看出，20%大蒜素·丁香酚水乳劑在所有稀釋倍數(shù)下對灰葡萄孢菌均有較好的抑菌效果，其500倍稀釋液與25%吡唑醚菌酯乳油1 500倍稀釋液的抑菌效果相當(dāng)。

表5 20%大蒜素·丁香酚水乳劑對灰葡萄孢菌的抑菌率（72h）

3 結(jié)論和討論

通過對乳化劑、結(jié)構(gòu)調(diào)整劑、防凍劑及其配比的篩選和優(yōu)化，確定了20%大蒜素·丁香酚水乳劑的最終配方為：大蒜素5%、丁香酚15%、復(fù)配乳化劑WJ-630 4%、WJ-990 1%、結(jié)構(gòu)調(diào)整劑聚乙二醇400 3%、防凍劑乙二醇3%，去離子水補足至100%，所制備的水乳劑各項指標(biāo)均達到產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。室內(nèi)生物活性測定結(jié)果表明，20%大蒜素·丁香酚水乳劑在稀釋500倍時，對灰葡萄孢菌的抑制率為92.41%，與25%吡唑醚菌酯乳油1 500倍稀釋液的抑菌效果相當(dāng)。

丁香酚和大蒜素均是從植物中提取的天然活性成分，具有良好的環(huán)境相容性，將其作為原藥制成水基化制劑水乳劑在病蟲害綠色防控中具有環(huán)保優(yōu)勢。但由于二者存在易氧化、水解等不穩(wěn)定性[15-16]，限制了其水基化制劑的開發(fā)和應(yīng)用推廣。本研究通過系統(tǒng)篩選水乳劑的助劑得到了穩(wěn)定配方，能夠為大蒜素和丁香酚相關(guān)制劑產(chǎn)品的研究提供參考。