劉青川 王盼麗 楊新波 王仁杰 王蒙蒙 黃正明

[摘要] 目的 觀察水芹總酚酸體外對乙型肝炎病毒（HBV）的抑制作用并探討其作用機(jī)制。 方法 水芹總酚酸對Hep AD38細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)分為水芹總酚酸組（細(xì)分為1600、800、400、200、100 μg/mL濃度組）和空白對照組。體外培養(yǎng)Hep AD38細(xì)胞，用MTT法檢測水芹總酚酸的毒性范圍。水芹總酚酸體外抗HBV作用實(shí)驗(yàn)分為水芹總酚酸組（細(xì)分為200、100、50、25 μg/mL濃度組）、陽性對照組[恩替卡韋（ETV） 10 μmol/L]和病毒對照組。用無毒濃度以下的水芹總酚酸藥液處理Hep AD38細(xì)胞，連續(xù)6 d，收取上清和細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測上清中HBsAg、HBeAg滴度;實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)HBV DNA載量。水芹總酚酸對鴨乙型肝炎病毒（DHBV）DNA聚合酶的影響實(shí)驗(yàn)分為水芹總酚酸組（細(xì)分為400、200、100、50、25 μg/mL濃度組）、陰性對照組和DHBV DNA聚合酶對照組。從感染鴨乙肝病毒的鴨肝中提取DHBV DNA聚合酶，分別給予不同濃度水芹總酚酸藥液，采用ELISA法檢測水芹總酚酸對DHBV DNA聚合酶活性的影響。 結(jié)果 水芹總酚酸對Hep AD38細(xì)胞的無毒濃度為400 μg/mL。與病毒對照組比較，水芹總酚酸組中的200、100、50 μg/mL濃度組的HBsAg、HBeAg滴度和HBV DNA載量均明顯降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）;與DHBV DNA聚合酶對照組比較，水芹總酚酸組中的400、200、100 μg/mL濃度組可抑制DHBV DNA聚合酶活性，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 水芹總酚酸體外具有良好的抗HBV作用，其作用機(jī)制包括抑制HBV DNA聚合酶的活性。

[關(guān)鍵詞] 水芹總酚酸;Hep AD38細(xì)胞;乙型肝炎病毒;乙肝病毒DNA聚合酶

[中圖分類號] R965 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2019）10（a）-0012-06

Study on anti-HBV effect of total phenolics acid from Oenanthe Javanica in vitro and its mechanism

LIU Qingchuan1 ? WANG Panli2 ? YANG Xinbo1 ? WANG Renjie1 ? WANG Mengmeng1 ? HUANG Zhengming1

1.Beijing Weijian Jiye Institute of Biotechnology， Beijing ? 100039， China; 2.Department of Pharmacy， People′s Hospital of Shigatse， Tibet Autonomous Region， Xigaze ? 857000， China

[Abstract] Objective To observe the inhibitory effect of total phenolics acid from Oenanthe Javanica on hepatitis B virus （HBV） in vitro and explore its mechanism. Methods The toxicity of total phenolics acid from Oenanthe Javanica to Hep AD38 cells was divided into the total phenolics acid from Oenanthe Javanica group （subdivided into 1600， 800， 400， 200， 100 μg/mL concentration groups） and the blank control group. Hep AD38 cells were cultured in vitro and the toxicity range of total phenolics acid from Oenanthe Javanica was determined by MTT assay. In vitro anti-HBV effects of total phenolics acid from Oenanthe Javanica were divided into the total phenolics acid from Oenanthe Javanica group （subdivided into 200， 100， 50 and 25 μg/mL concentration groups）， the positive control group [Entecavir （ETV） 10 μmol/L] and the virus control group. Hep AD38 cells were treated with total phenolics acid from Oenanthe Javanica solution with a concentration below the non-toxic concentration for 6 consecutive days. The supernatant and cells were collected. The titer of HBsAg and HBeAg in the supernatant was detected by enzyme linked immune sorbent assay （ELISA）. The intracellular HBV DNA load was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The effects of total phenolics acid from Oenanthe Javanica on duck hepatitis B virus （DHBV） DNA polymerase were divided into the total phenolics acid from Oenanthe Javanica group （subdivided into 400， 200， 100， 50 and 25 μg/mL concentration groups）， the negative control group and the DHBV DNA polymerase control group. DHBV DNA polymerase was extracted from duck liver infected with duck hepatitis B virus， different concentrations of total phenolics acid from Oenanthe Javanica solution were given， and the effects of total phenolics acid from Oenanthe Javanica on DHBV DNA polymerase activity were detected by ELISA. Results The non-toxic concentration of total phenolics acid from Oenanthe Javanica in Hep AD38 cells was 400 μg/mL. Compared with the virus control group， HBsAg， HBeAg titer and HBV DNA load were significantly decreased in the 200， 100 and 50 μg/mL concentration groups of the total phenolics acid from Oenanthe Javanica group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the DHBV DNA polymerase control group， DHBV DNA polymerase activity was inhibited in the 400， 200， and 100 μg/mL concentration groups of the total phenolics acid from Oenanthe Javanica group， the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Conclusion Total phenolics acid from Oenanthe Javanicahas a good anti-HBV effect in vitro， and its mechanism includes inhibition of HBV DNA polymerase activity.

[Key words] Total phenolics acid from Oenanthe Javanica; Hep AD38 cells; Hepatitis B viral; Hepatitis B viral DNA polymerase

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的可能威脅生命的肝臟感染，可分為急性乙型肝炎和慢性乙型肝炎，是全世界引起肝炎性死亡人數(shù)最多的疾病。據(jù)2017年WHO發(fā)布的《全球肝炎報(bào)告》數(shù)據(jù)顯示，2015年全球有2.57億乙肝病毒感染者，占世界人口的3.5%，其中乙型肝炎導(dǎo)致88.7萬人死亡，大多死于并發(fā)癥（包括肝硬化和肝細(xì)胞癌）。雖然這一系列數(shù)字較往年有下降趨勢，但乙型肝炎仍是一個(gè)嚴(yán)重的全球衛(wèi)生問題。

作為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)，中藥用于治療乙型肝炎有著兩千多年的歷史，多部著名醫(yī)藥典籍中均有收錄對于治療乙型肝炎效果確切的中草藥，其中水芹就出自《本草綱目》，近代藥理學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)其具有很好的抗肝炎作用[1]。水芹總酚酸是從水芹全草中提取，經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)，水芹總酚酸對乙肝病毒具有穩(wěn)定的抑制作用，可降低Hep G2.2.15細(xì)胞上清中乙肝表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的滴度，抑制細(xì)胞內(nèi)HBV DNA的復(fù)制[2-3]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水芹總酚酸可有效抑制鴨血清中鴨乙型肝炎病毒（DHBV）DNA的復(fù)制，且停藥后無反跳現(xiàn)象[4]。此外，水芹總酚酸還具有保肝降酶和退黃的作用[5]。由此可見，水芹總酚酸治療乙型肝炎的臨床開發(fā)前景可觀。本研究采用Hep AD38細(xì)胞模型來驗(yàn)證水芹總酚酸抗HBV活性，建立DHBV DNA聚合酶活性的檢測方法，并通過檢測DHBV DNA聚合酶的活性探討其抗HBV的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和動物

Hep AD38細(xì)胞是人肝細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系，在四環(huán)素的調(diào)控下產(chǎn)生HBV。北京麻鴨，1～2日齡，購自北京前進(jìn)種鴨場，飼養(yǎng)于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心，清潔級別為普通級，籠具用過氧乙酸溶液消毒，飲用水為消毒水，室溫恒為25℃，相對濕度為40%～70%。

1.2 主要試劑和儀器

水芹總酚酸，北京衛(wèi)健基業(yè)生物技術(shù)研究所提取精制（批號：20180312）;恩替卡韋（ETV），解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝衰竭研究室饋贈;DME/F-12（HyClone，貨號：SH30023.01）;FBS（Corning，貨號：35-010-CVR）;MTT（AMRESCO，貨號：0793）;QuickExtract DNA Extraction Soln 1.0提取液（美國Epicentre）;HBV DNA TaqMan熒光定量檢測試劑盒（北京巴奧瑞生物科技有限公司，批號：20180512）;HBsAg、HBeAg酶聯(lián)免疫試劑盒（北京科華生物技術(shù)有限公司，批號：201708151）;牛血清白蛋白（BSA）（AMRESCO，貨號：0332）;Bio-dUTP，上海生工合成;dTTP，Oligo（dT）15及其他相關(guān)引物，大連寶生物合成;堿磷酶標(biāo)記鏈親合素（APS）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）;BCA蛋白含量測定試劑盒（Pierce公司，貨號：23228）;EDC（J&K公司）;DTT、poly A、PNPP（Sigma）。二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司;96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Corning公司;倒置顯微鏡，日本Olympus公司;低溫高速離心機(jī)，美國Thermo公司;實(shí)時(shí)電子分析天平，上海天平儀器廠;酶聯(lián)儀，美國Bio-RAD公司;生物安全柜，美國Thermo公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 SLAN 8.0，上海宏石醫(yī)療科技有限公司;NH微孔板，Nunc公司;漩渦混勻器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;恒溫水浴鍋，Grant公司;智能超速離心機(jī)，美國Beckham公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理

①水芹總酚酸對Hep AD38細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)分為水芹總酚酸組（細(xì)分為1600、800、400、200、100 μg/mL濃度組，同時(shí)由于水芹總酚酸本身呈褐色，每個(gè)濃度藥液設(shè)1個(gè)本底對照孔）和空白對照組;②水芹總酚酸體外抗HBV作用實(shí)驗(yàn)分為水芹總酚酸組（細(xì)分為200、100、50、25 μg/mL濃度組），陽性對照組（ETV 10 μmol/L）和病毒對照組;③水芹總酚酸對DHBV DNA聚合酶的影響實(shí)驗(yàn)分為水芹總酚酸組（細(xì)分為400、200、100、50、25 μg/mL濃度組），陰性對照組和DHBV DNA聚合酶對照組。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 水芹總酚酸對Hep AD38細(xì)胞毒性的影響

Hep AD38細(xì)胞接種至96孔板中，分別給予各濃度組別的藥液，每孔0.2 mL，每濃度3孔，同法設(shè)置培養(yǎng)液空白對照組。給藥3 d，每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，孵育6 h后，吸出培養(yǎng)液，沉淀用二甲基亞礬（DMSO）溶解，于490 nm處檢測吸光度。

1.4.2 水芹總酚酸對Hep AD38細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA及上清分泌HBsAg、HBeAg含量的影響

Hep AD38細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到2×105個(gè)細(xì)胞/mL時(shí)，接種至96孔板中，待細(xì)胞貼壁后分別給予各濃度組別的藥液，每孔0.2 mL，每濃度3孔，同法設(shè)置陽性對照組（ETV 10 μmol/L）和病毒對照組（培養(yǎng)液）。給藥第3天換同濃度藥液;給藥第6天收集細(xì)胞和上清。上清液用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）實(shí)驗(yàn)檢測試劑盒檢測HBsAg和HBeAg的含量;細(xì)胞用DNA快速提取液抽提總DNA，采用HBV DNA TaqMan熒光定量檢測試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA表達(dá)量。PCR體系：待測樣本3 μL，HBV-PCR反應(yīng)液（OT）30 μL，HBV酶混合物1.5 μL。PCR反應(yīng)程序：尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG酶）反應(yīng)37℃ 2 min→95℃ 3 min→[95℃ 10 s→60℃ 35 s（45個(gè)循環(huán)）]→25℃ 10 s。

1.4.3 水芹總酚酸對DHBV DNA聚合酶活性的影響

1.4.3.1 DHBV DNA聚合酶的提取 ?雛鴨注射DHBV病毒強(qiáng)陽性血清，7 d后取肝，肝勻漿之后利用蔗糖濃度梯度法純化獲得DHBV DNA聚合酶，提取流程如下：取感染DHBV的鴨肝，勻漿;11 000 r/min，4℃離心30 min后取上清;上清45 000 r/min，4℃，離心3 h得到沉淀物;沉淀物用蔗糖濃度梯度離心，按不同的蔗糖濃度分層取出液體;各部分45 000 r/min，4℃，離心10 h得到沉淀，提取物放入-80℃保存。

1.4.3.2 DHBV DNA聚合酶活性檢測 ?將通用引物Oligo（dT）15溶于100 mmol/L的1-甲基-咪唑的鹽酸緩沖液中，加入96孔NH酶標(biāo)板中，與水溶性碳化二亞胺混勻，于50℃水浴中反應(yīng)4 h，反應(yīng)結(jié)束后用洗液（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5）洗三遍，除去未結(jié)合的Oligo（dT）15，將包被后的96孔板置于4℃保存。實(shí)驗(yàn)設(shè)水芹總酚酸各濃度藥液、DHBV DNA聚合酶對照組和陰性對照液。水芹總酚酸各濃度藥液分別加入到用磷酸緩沖鹽液（PBS）洗過的96孔培養(yǎng)板中，每孔10 μL（DHBV DNA聚合酶對照組和陰性對照液組以PBS代替），每濃度3孔，然后加入每孔70 μL的RT Buffer[含poly（A）、dTTP、bio-dUTP]，每孔20 μL的含DHBV聚合酶的PBS溶液（陰性對照液組以PBS代替），使反應(yīng)系統(tǒng)總體積為100 μL。37℃水浴反應(yīng)1 h，Washing buffer洗板3次，除去未結(jié)合的游離底物，再每孔加入100 μL 1% BSA，室溫封閉1 h，Washing buffer洗板3次。每孔加入50 μL的SA-ALP稀釋液（100 ng/mL），37℃水浴1 h，洗板后，每孔再加入100 μL PNPP（1 mg/mL），37℃水浴30 min;每孔50 μL加入1 mol/L的NaOH終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定405 nm波長處吸光度（OD）值，計(jì)算化合物在該濃度的抑制率，以確定化合物對DHBV聚合酶的抑制活性。用Reed-Meuench公式計(jì)算半抑制濃度（IC50）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水芹總酚酸對Hep AD38細(xì)胞的毒性作用

本實(shí)驗(yàn)中，由于水芹總酚酸給藥濃度過高會出現(xiàn)析出現(xiàn)象，故將最高給藥濃度定為1600 μg/mL。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水芹總酚酸各濃度組扣除本底后，與空白對照組比較，1600 μg/mL濃度組對細(xì)胞生長有一定的抑制作用，抑制率為35.62%，其余各濃度組未發(fā)現(xiàn)明顯的抑制作用，抑制效果呈現(xiàn)量效關(guān)系。結(jié)果表明，水芹總酚酸對Hep AD38細(xì)胞的毒性較低，半數(shù)毒性濃度（TC50）>1600 μg/mL，最大無毒濃度（TC0）為400 μg/mL。見表1、圖1。

2.2 水芹總酚酸對Hep AD38細(xì)胞抗HBV的影響

根據(jù)水芹總酚酸對Hep AD38細(xì)胞的毒性結(jié)果，將其藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)的最高濃度設(shè)為200 μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水芹總酚酸給藥第6天時(shí)，可以降低Hep AD38細(xì)胞上清中HBsAg、HBeAg滴度，200、100、50 μg/mL水芹總酚酸組與病毒對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），25 μg/mL水芹總酚酸組與病毒對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。用標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒PCP10作HBV-DNA擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測細(xì)胞內(nèi)HBV-DNA載量。結(jié)果顯示，水芹總酚酸各劑量組在給藥6 d后，可以有效地抑制細(xì)胞HBV-DNA的復(fù)制，200、100、50 μg/mL濃度組與病毒對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），量效關(guān)系明顯。見表2、圖2。

2.3 水芹總酚酸對DHBV DNA聚合酶活性的影響

水芹總酚酸對DHBV聚合酶有顯著的抑制作用。抑制率隨著藥物濃度的增大而升高，400、200、100 μg/mL水芹總酚酸組對DHBV聚合酶的平均抑制率分別為93.62%、81.51%、57.50%，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，與DHBV DNA聚合酶對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表3、圖3。

注：與DHBV DNA聚合酶對照組比較，bP < 0.05，cP < 0.01。DHBV DNA：鴨乙型肝炎病毒DNA;IC50：半抑制濃度?！?”表示無數(shù)據(jù)

3 討論

水芹總酚酸作為水芹生藥中提取的有效部位，具有穩(wěn)定的提取工藝和質(zhì)量控制方法。其粗略提取流程為：水芹全草經(jīng)乙醇加熱回流，放冷過濾，加壓回收溶劑得浸膏，浸膏以熱蒸餾水溶解過濾，得到的水溶液在聚酰胺柱上以乙醇洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮，真空干燥得水芹總酚酸提取物。用Folin-酚法[6]作為水芹總酚酸中總酚酸物質(zhì)和其代表成分綠原酸的質(zhì)量控制方法，測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)總酚酸含量>50%，綠原酸含量約為7%。

病毒的生命周期包含吸附、穿入、脫殼、生物合成及裝配分泌等階段，每個(gè)階段都有相應(yīng)的藥物阻斷靶點(diǎn)[7]。近年來抗HBV藥物機(jī)制研究較多的靶點(diǎn)有病毒侵入階段的鈉離子-?；悄懰釁f(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NTPC）[8]，病毒合成階段的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）、HBV DNA聚合酶[9]、前基因組RNA（pgRNA）[10]、siRNA，病毒裝配階段的核心蛋白[11]以及一些調(diào)控蛋白等。水芹總酚酸在之前的研究中已經(jīng)明確了其抗HBV的活性，但是沒有對其作用機(jī)制進(jìn)行研究。本試驗(yàn)選用Hep AD38細(xì)胞，可以在觀察受試物抗HBV作用活性的同時(shí)間接反映出其抗HBV的作用位點(diǎn)，可能為抑制HBV復(fù)制周期中的特定步驟或是抑制負(fù)責(zé)pgRNA轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動子[12]。體外結(jié)果提示，水芹總酚酸具有良好的抗HBV活性，作用持久穩(wěn)定，推測其作用靶點(diǎn)可能是抑制HBV復(fù)制周期中的特定步驟。本課題組在對水芹總酚酸抗艾滋?。℉IV）的研究中發(fā)現(xiàn)其可通過抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性阻止HIV復(fù)制，而現(xiàn)今臨床常用抗HBV的核苷類似物，其最初的研究方向也是抗HIV，后因發(fā)現(xiàn)其可通過抑制HBV DNA聚合酶的活性阻止HBV的復(fù)制[13]，將研發(fā)重點(diǎn)轉(zhuǎn)到了HBV領(lǐng)域。此外，HBV DNA聚合酶具有多重功能域，在參與完成HBV DNA合成以及RNA模板降解過程中起重要作用，篩選靶向HBV DNA聚合物的藥物可有效阻斷HBV生命周期[14-16]。綜上考慮，本課題組對水芹總酚酸抗HBV的作用機(jī)制重點(diǎn)放在對HBV DNA聚合酶活性的研究。

近年來，HBV DNA聚合酶的檢測方法主要是用同位素標(biāo)記，以液閃儀測定同位素放射性度（CPM）[17-19]。由于同位素具有很強(qiáng)的放射性，對人體產(chǎn)生很大的輻射作用，國家對其使用把控嚴(yán)格，且對實(shí)驗(yàn)室要求較高，不適用于一般科研單位，從而限制了廣大科研工作者的相關(guān)研究。目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道利用非同位素標(biāo)記法測定DHBV DNA聚合酶活性。本研究所同北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院共同研究，參考其對HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶的活性測定方法[20]，建立了非同位素標(biāo)記測定DHBV DNA聚合酶活性的方法[21]（專利申請?zhí)枺?01810302359.2）。其測定原理為：利用NH微孔板，將Oligo（dT）15引物固定到模板上，通過DHBV DNA聚合酶的活性反應(yīng)將dTTP和bio-dUTP連接到Oligo（dT）15相連的poly（A）上，利用免疫反應(yīng)再將堿性磷酸酶連接上去，最后通過化學(xué)發(fā)光底物PNPP反應(yīng)使體系顯色。經(jīng)驗(yàn)證該檢測方法，檢測靈敏度更高，方法穩(wěn)定，且更加簡單方便。本研究通過ELISA檢測出水芹總酚酸對HBV DNA聚合酶的IC50為90.71 μg/mL，表明水芹總酚酸是一種作用較強(qiáng)的HBV DNA聚合酶抑制劑。

綜上所述，水芹總酚酸作為一種抗病毒的中藥五類新藥，對乙型肝炎、艾滋病、白血病等病毒的抑制作用明確且穩(wěn)定，結(jié)合其對HBV DNA聚合酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶均具有較強(qiáng)的抑制作用[22-23]，可推測水芹總酚酸是一種廣譜抗病毒的酶抑制劑，具有較高抗病毒藥物研究的價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] ?黃正明，楊新波，曹文斌.水芹的本草考證[J].中草藥，2001，32（1）：59-62.

[2] ?王選舉，黃正明，楊新波，等.水芹總酚酸對2.2.15細(xì)胞HBV DNA、cccDNA的抑制作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2009， 25（8）：1099-1102.

[3] ?王選舉，黃正明，楊新波，等.水芹總酚酸對2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg與HBeAg的抑制作用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（2）：148-151.

[4] ?王選舉，黃正明，楊新波，等.水芹總酚酸對鴨乙肝病毒DNA的抑制作用[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25（6）：501-505.

[5] ?Ai G，Huang ZM，Liu QC，et al. The protective effect of total phenolics from Oenanthe Javanica on acute liver failure induced by D-galactosamine [J]. J Ethnopharmacol，2016，186：53-60.

[6] ?田丹，陳勁春，楊新波，等.水芹總酚酸膠囊質(zhì)量控制方法的研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（4）：328-331.

[7] ?赫曉林，黃建煒，許瑞安，等.HBV病毒復(fù)制機(jī)制及慢性乙型肝炎藥物靶點(diǎn)[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（2）：152-156.

[8] ?Fukano K，Tsukuda S，Watashi K，et al. ConceptofViralInhibitorsviaNTCP [J]. Semin Liver Dis，2019，39（1）：78-85.

[9] ?Tang L，Sheraz M，McGrane M，et al. DNA Polymerase alpha is essential for intracellular amplification of hepatitis B virus covalently closed circular DNA [J]. PLoS Pathog，2019，15（4）：e1007742.

[10] ?葉雨笙，朱紫衣，劉晨霞，等.紅景天苷對HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制的影響及機(jī)制研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，54（4）：539-543.

[11] ?Li Y，Sun Y，Sun F，et al. Mechanisms and Effects on HBV Replication of the Interaction between HBV Core Protein and Cellular Filamin B [J]. Virol Sin，2018，33（2）：162-172.

[12] ?King RW，Ladner SK. Hep AD38 Assay：A High-Throughput， Cell-Based Screen for the Evaluation of Compounds Against Hepatitis B Virus [J]. Methods Mol Med，2000， 24：43-50.