吳 蓉，范勝蓮

（四川省攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，四川 攀枝花 617000）

山楂、麥芽、神曲俗稱(chēng)“焦三仙”，其中山楂為薔薇科植物山里紅Crataegus pinnatifidaBge.Var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifidaBge.的干燥成熟果實(shí)。小兒麥棗咀嚼片由山藥、大棗、山楂和麥芽4味藥材經(jīng)現(xiàn)代工藝制成，收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品標(biāo)準(zhǔn) WS-10409（ZD-0409）-2002-2012Z，臨床主要用于治療小兒脾胃虛弱、食欲不振、食積不化，有健脾和胃作用[1-3]。處方中的山楂和麥芽有健胃消食、行氣散瘀、去積滯、助消化功效，山楂和大棗具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、益氣補(bǔ)中、養(yǎng)血安神功效[4-6]。山楂中發(fā)揮消食作用的主要是成分是有機(jī)酸，其中以枸櫞酸的含量最高[7-9]。2015年版《中國(guó)藥典（一部）》山楂項(xiàng)下總有機(jī)酸的測(cè)定是以枸櫞酸的含量計(jì)算，但采用的滴定法在滴定過(guò)程中影響因素較多，且樣品顏色較深，不易準(zhǔn)確測(cè)定。本試驗(yàn)中參考文獻(xiàn)[10-15]對(duì)其測(cè)定方法進(jìn)行了改進(jìn)，建立了高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定山楂藥材和小兒麥棗咀嚼片中枸櫞酸的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate3000型高效液相色譜儀，包括全自動(dòng)進(jìn)樣器、恒溫柱溫箱、VWD檢測(cè)器、變色龍Chromeleon7工作站（美國(guó)賽默飛世爾公司）；AE240型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

山楂藥材（批號(hào)分別為 181012，180502，180901，181203，190101）來(lái)源于攀枝花市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，經(jīng)該院范勝蓮副主任中藥師鑒定為正品。小兒麥棗咀嚼片（葵花藥業(yè)集團(tuán)＜佳木斯＞有限公司，批號(hào)分別為201801009，201811002，201812005，規(guī)格為每片 0.45 g）；枸櫞酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100396-201102，含量 99.9% ）；甲醇為色譜純，磷酸二氫銨、磷酸均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Welch-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相:甲醇（A）-0.5%磷酸二氫銨（B，磷酸調(diào)pH至2.8）溶液（5 ∶95，V／V）；流速:0.8 mL ／min；柱溫:25 ℃ ；檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm；進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液:稱(chēng)取在105℃干燥2 h后的枸櫞酸對(duì)照品11.98 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL容量瓶中，加水定容，作對(duì)照品貯備液；精密吸取2 mL置5 mL容量瓶中，加甲醇定容，作對(duì)照品溶液（每1mL含枸櫞酸0.4792mg）。

供試品溶液:取山楂藥材（批號(hào)181012），粉碎，過(guò)3號(hào)篩，稱(chēng)取粉末0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，靜置2 h，超聲（功率270 W，頻率40 kHz）處理30 min，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，作供試品溶液Ⅰ。取小兒麥棗咀嚼片（批號(hào)201801009）10片，研細(xì)，混勻，稱(chēng)取粉末3.0 g，精密稱(chēng)定，后同法操作，得供試品溶液Ⅱ。

陰性對(duì)照溶液:按小兒麥棗咀嚼片處方量的1／10制備缺山楂藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn):精密吸取2.2項(xiàng)下4種溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果陰性對(duì)照溶液在與對(duì)照品溶液相同保留時(shí)間處無(wú)色譜峰（圖1），說(shuō)明該方法的專(zhuān)屬性強(qiáng)，理論板數(shù)以枸櫞酸峰計(jì)不低于9000，分離度均大于1.5。

線性關(guān)系考察:取對(duì)照品貯備液作為5號(hào)對(duì)照品溶液；精密吸取2 mL，置10 mL容量瓶中，作為4號(hào)對(duì)照品溶液；然后精密吸取對(duì)照品溶液各1 mL，分別置25，50，100 mL容量瓶中，作為3號(hào)、2號(hào)、1號(hào)對(duì)照品溶液。分別吸取上述 1～5號(hào)對(duì)照品溶液各 10 μL，按 2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以進(jìn)樣量（，ng）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.0834+3.7633，r=0.9999（n=5）。結(jié)果表明，枸櫞酸進(jìn)樣量在47.92～11980.00 ng范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):分別取上述1號(hào)、3號(hào)和5號(hào)對(duì)照品溶液，各連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD分別為2.06%，1.22%，0.42%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取供試品溶液，室溫下分別放置0，1，2，4，8，12，24h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果山楂藥材和小兒麥棗咀嚼片中枸櫞酸峰面積的RSD分別為2.83%和2.19%（n=7），表明供試品溶液室溫下放置24h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):分別取山楂藥材（批號(hào)181012）和小兒麥棗咀嚼片（批號(hào)201801009），依法同時(shí)制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果的RSD分別為 0.78%和 1.24% （n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):稱(chēng)取已知含量的山楂藥材粉末共6份，每份0.25 g，同時(shí)稱(chēng)取已知含量的小兒麥棗咀嚼片6份，每份1.5 g，精密稱(chēng)定，分別加入適量枸櫞酸對(duì)照品溶液，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中枸櫞酸的加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 高效液相色譜圖

表1 枸櫞酸加樣回收試驗(yàn)（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取不同批次的2種樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。并將結(jié)果與原標(biāo)準(zhǔn)中的滴定法進(jìn)行比較，2種方法測(cè)得結(jié)果的RSD均小于3%，表明該方法可行。

表2 山楂藥材和小兒麥棗咀嚼片中枸櫞酸含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品制備方法選擇

枸櫞酸是極性較大的有機(jī)酸，通常應(yīng)采用正相色譜柱進(jìn)行分離，采用反相色譜柱分離時(shí)具有出峰速度快、不易受溶劑峰影響的優(yōu)點(diǎn)，且枸櫞酸易溶于水，因此在制備供試品時(shí)首先參考山楂藥材中枸櫞酸含量測(cè)定的處理方法。采用水作為提取溶劑進(jìn)行浸泡，由于浸泡所需時(shí)間長(zhǎng)，因此本試驗(yàn)中在浸泡的基礎(chǔ)上又進(jìn)行超聲處理，提高了提取效率。分別采用乙醇、50%甲醇和水3種溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水的提取效率最高，后采用正交試驗(yàn)對(duì)提取溶劑的量、提取時(shí)間、超聲功率等因素進(jìn)行綜合考察，最后確定樣品取樣量為3.0 g，浸泡2 h后再超聲30 min為最佳提取方法。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)及流動(dòng)相選擇

在190～300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)枸櫞酸對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在210 nm波長(zhǎng)附近有最大吸收，因此選擇210 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。選擇流動(dòng)相時(shí)先后采用甲醇 -0.1%磷酸溶液（5 ∶95，V／V）、乙腈 -0.2%磷酸二氫銨（磷酸調(diào)pH至3.0）溶液、甲醇-0.5%磷酸二氫銨（磷酸調(diào) pH 至 2.8）溶液（5 ∶95，V／V）等進(jìn)行洗脫。結(jié)果以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，峰形不對(duì)稱(chēng)，拖尾嚴(yán)重；乙腈-0.2%磷酸二氫銨（磷酸調(diào)pH至3.0）溶液作流動(dòng)相時(shí)出峰較快，溶劑峰干擾較大。由于枸櫞酸在水溶液中很容易電離，產(chǎn)生多峰現(xiàn)象，為了使其盡可能地以分子形式存在，一般在流動(dòng)相中加酸來(lái)抑制枸櫞酸的解離。以本試驗(yàn)中選擇的甲醇-0.5%磷酸二氫銨（磷酸調(diào) pH 至 2.8）溶液（5 ∶95，V／V）為流動(dòng)相時(shí)，枸櫞酸的色譜峰分離較好，峰形對(duì)稱(chēng)。且以緩沖液作為流動(dòng)相易控制其pH，從而保證樣品的重復(fù)性。

綜上所述，本研究中建立的HPLC法測(cè)定結(jié)果與原標(biāo)準(zhǔn)中的滴定法無(wú)顯著差異，可用于山楂藥材和小兒麥棗咀嚼片中枸櫞酸的含量測(cè)定。同時(shí)，HPLC法靈敏度高、分析速度快、抗干擾強(qiáng)，更適用于中成藥及基質(zhì)復(fù)雜樣品中枸櫞酸含量的測(cè)定。