盧雪盈 ，彭怡文 ，姜新根 ，王玉梅 ，趙金花 ，張尚斌 ，陳劍平 ，胡世平 △

（1.廣東省深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518172； 2.廣東省深圳市中醫(yī)院·深圳市醫(yī)院中藥制劑研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518033）

肝纖方又名益肝化瘀方，是深圳市龍崗區(qū)中醫(yī)院胡世平主任醫(yī)師的臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有疏肝理氣、活血化瘀、健脾祛濕的功效，主要用于治療慢性肝纖維化、慢性肝病及終末期肝病，對(duì)兼有濕濁、血瘀等證療效顯著。為了方便服用并保證原方療效，醫(yī)院將其進(jìn)一步研制成質(zhì)量可控的中藥顆粒劑。本研究中先確定醋鱉甲的先煎工藝，再采用正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。由于丹參中的丹酚酸B具有抗纖維化作用[1]，故以丹酚酸B為含量測(cè)定指標(biāo)，并綜合總固形物質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜（HPLC）儀，包括柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、LC solution色譜工作站（日本島津公司）；AUW220D型電子天平（十萬(wàn)分之一，日本島津公司）；CQ-250-DST型超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠(chǎng)）；LD5-2A型低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）。

1.2 試藥

柴胡、當(dāng)歸、赤芍、白芍、醋莪術(shù)、醋鱉甲、丹參、醋香附、黨參、麩炒蒼術(shù)、白術(shù)、茯苓、澤瀉、黃芪、垂盆草、葉下珠、醋青皮、陳皮（深圳華輝藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為 171104，20171102，17061001，17112901，17110601，17091001，17121001，1711083，17112601，20171018，171101，171101，1704001，20171202，170901，17051101，170701，1709030302），均經(jīng)深圳市中醫(yī)院張尚斌主任中藥師鑒定為正品；丹酚酸B對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為 111562-201716，含量以94.1% 計(jì)）；乙腈為色譜純（默克公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 先煎提取工藝考察[2]

因方中含有醋鱉甲藥味，按傳統(tǒng)工藝煎煮提取要求，需對(duì)其進(jìn)行先煎考察。故本研究中采用單因素考察法，加水單煎醋鱉甲制得先煎考察樣品，以水溶性固形物質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)藥材粉碎粒度和提取時(shí)間進(jìn)行考察。

水溶性固形物質(zhì)量的測(cè)定[3]:精密量取各樣品溶液50 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，100℃水浴蒸干，于105℃干燥至恒重。按2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0831干燥失重測(cè)定法測(cè)定，計(jì)算固形物含量。

固形物含量（%）=（50 mL濃縮液中固形物質(zhì)量×250）／（醋鱉甲質(zhì)量 ×250）×100%

不同粉碎粒度的醋鱉甲單煎考察:取醋鱉甲的飲片、最粗粉、粗粉、中粉各50g，精密稱(chēng)定，分別加水500mL，煎煮1 h，過(guò)濾，濃縮，定容至250 mL，測(cè)定水溶性固形物質(zhì)量，計(jì)算固形物含量。結(jié)果飲片煎煮所得固形物含量較低（8.21% ），最粗粉（10.19% ）、粗粉（9.88% ）、中粉（10.95%）的固形物含量差異不大。

不同煎煮時(shí)間單煎考察:取醋鱉甲最粗粉5份，各50 g，精密稱(chēng)定，加水 500 mL，分別煎煮 0.5，1.0，1.5，2.0 h，過(guò)濾，濃縮，定容至250 mL，測(cè)定水溶性固形物質(zhì)量，計(jì)算固形物含量。結(jié)果固形物含量分別為 10.19%，10.82% ，10.72%，10.43%?？梢?jiàn)，煎煮 0.5 h 后對(duì)固形物含量的影響差異不大。

綜合固形物含量及時(shí)間成本等因素，醋鱉甲先煎提取優(yōu)選工藝的粉碎粒度為最粗粉，先煎時(shí)間為0.5h。

2.2 水提取工藝考察

2.2.1 因素水平

根據(jù)前期預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，分別以加水倍數(shù)（因素A）、提取次數(shù)（因素B）、煎煮時(shí)間（因素C）為考察因素，每個(gè)因素各取3個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)法，以丹參中丹酚酸B含量和總固形物質(zhì)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行優(yōu)選。因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 因素水平表

2.2.2 樣品制備

按優(yōu)選的先煎工藝條件，對(duì)醋鱉甲進(jìn)行先煎提取，在醋鱉甲先煎提取液與藥渣中，加入丹參、黃芪等17味藥材，按表1所示正交試驗(yàn)因素水平表進(jìn)行提取，濾過(guò)，合并濾液，濾液全部濃縮至約300 mL，用少量蒸餾水清洗濃縮鍋多次，全部轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，定容，搖勻，取適量濃縮液，4500 r／min離心5 min，取上清液，測(cè)定丹酚酸B含量和總固形物質(zhì)量。

2.2.3 總固形物測(cè)定[4]

精密量取樣品50 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿，在水浴上蒸干后，參照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則2201浸出物測(cè)定法，于105℃下干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，立即稱(chēng)定質(zhì)量，按公式計(jì)算總固形物含量。

總固形物質(zhì)量（g）=（50 mL濃縮液中固形物質(zhì)量／g×500 mL）／50 mL

2.2.4 丹酚酸B含量測(cè)定

色譜條件[5]:色譜柱為InertsilODS-SP柱（150mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈 -0.1% 磷酸溶液（22 ∶78，V／V）；流速為 1.2 mL ／min；二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm。

溶液制備:取丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加80%甲醇溶解并制成每1 mL含丹酚酸B約1 mg的溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液。取2.2.2項(xiàng)下的樣品溶液適量，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按優(yōu)選的先煎工藝條件，對(duì)醋鱉甲進(jìn)行先煎提取，在醋鱉甲先煎提取液與藥渣中，加入黃芪等16味藥材（除丹參外），加10倍量水，提取2次，每次2 h，制得不含丹參的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

專(zhuān)屬性試驗(yàn):取上述3種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與丹酚酸B、供試品溶液色譜相應(yīng)位置上無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明方法專(zhuān)屬性良好（見(jiàn)圖1）。

圖1 高效液相色譜圖

線(xiàn)性關(guān)系考察:精密吸取對(duì)照品溶液（1060μg／mL），加 80% 甲醇制成每 1 mL 含 1000，800，600，400，200，100，80，60，40，20 μg 的溶液。按擬訂色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得峰面積。以進(jìn)樣量（，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程Y=1065 467.411-23845.970，r=0.9999（n=10）。結(jié)果表明，丹酚酸 B進(jìn)樣量在 0.1036 ～4.1440 μg范圍內(nèi)與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好。

精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率試驗(yàn):按相關(guān)方法進(jìn)行操作，結(jié)果精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗(yàn)結(jié)果的RSD均小于2.0%（n=6），平均加樣回收率為98.85%，表明該方法穩(wěn)定、可行。

2.2.5 水提正交試驗(yàn)結(jié)果

采用綜合加權(quán)評(píng)分法[4]，以總固形物質(zhì)量和丹酚酸B含量9次試驗(yàn)的最大值為100分，將各指標(biāo)成分的總量轉(zhuǎn)換為評(píng)分值，考慮到丹參在處方中為君藥，故總固形物質(zhì)量和丹酚酸B含量的加權(quán)系數(shù)分別設(shè)為0.5，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，篩選最佳工藝。結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

可見(jiàn)，提取條件以A3B3C3為佳。方差分析結(jié)果表明，提取次數(shù)對(duì)丹酚酸B含量和總固形物質(zhì)量具顯著性差異，且差異主要來(lái)源于第1水平與第2水平，而第2水平與第3水平差異不顯著，故選擇第2水平，即提取2次。綜合考慮，各因素影響水平為提取次數(shù)（B）＞加水量（A）＞提取時(shí)間（C），綜合考慮到縮短生產(chǎn)周期、降低生產(chǎn)成本等，故確定優(yōu)選提取工藝為黃芪、丹參等17味藥材，加10倍量水，提取2次，每次1 h。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證水提工藝的可行性，進(jìn)行3批重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。每批稱(chēng)取黃芪、丹參等18味藥材，照先煎工藝優(yōu)選結(jié)果和正交試驗(yàn)最佳提取工藝條件進(jìn)行提取，并測(cè)定水提液中丹酚酸B和總固形物質(zhì)量，計(jì)算綜合評(píng)分值。結(jié)果見(jiàn)表4?？梢?jiàn)，3次平行試驗(yàn)的干膏得率的平均值為31.25%，平均綜合評(píng)分為95.20分，與正交試驗(yàn)綜合評(píng)分最大值的結(jié)果接近，提示所篩選的提取工藝條件基本穩(wěn)定。

表4 優(yōu)選提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 提取工藝設(shè)計(jì)

肝纖方中有多味含揮發(fā)油成分的中藥，但收集以水提取的揮發(fā)油量較少，根據(jù)揮發(fā)油提取預(yù)試驗(yàn)結(jié)果及處方中揮發(fā)油的性質(zhì)分析，可能由于揮發(fā)油含量低、不穩(wěn)定、水溶性大[3]等因素，將所有藥材直接用水提取，成本低、安全性高，且與傳統(tǒng)工藝相契合[6]。

本研究中采用單因素試驗(yàn)法考察醋鱉甲先煎工藝、以正交試驗(yàn)法考察水提工藝，2種方法結(jié)合研究該處方的提取工藝，一方面可明顯縮短研究的時(shí)間，降低研究成本；另一方面可保證原方的提取效果[7]，盡可能與傳統(tǒng)工藝保持一致，從而為充分發(fā)揮臨床療效提供基礎(chǔ)。采用正交試驗(yàn)進(jìn)行水提工藝優(yōu)化，綜合考慮提取過(guò)程的各種影響因素，明確各因素的影響程度和相互作用，獲得諸因素各水平的最佳搭配，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)優(yōu)選最佳工藝條件。預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)水提液濃縮至相對(duì)密度大約為 1.20（70 ～80 ℃）時(shí)，與輔料（糊精、蔗糖粉）混合，利于顆粒的成型，顆粒外觀(guān)、均一度、成型率和溶化性等均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步提示該方水提工藝合理、可行。

3.2 指標(biāo)成分選擇與綜合評(píng)分權(quán)重比例

丹參為方中君藥，結(jié)合預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，指標(biāo)成分選擇其水溶性有效成分丹酚酸B。測(cè)定方法參照藥典方法，結(jié)果丹酚酸B色譜峰分離良好，與其他成分不互相干擾，保留時(shí)間適中。曾考察以丹酚酸B和丹參酮為正交試驗(yàn)的指標(biāo)成分，建立多指標(biāo)成分評(píng)價(jià)方法，綜合優(yōu)選水提工藝。但由于丹參酮為脂溶性成分，在水提液中含量較低，故最終僅選取丹酚酸B作為正交試驗(yàn)的指標(biāo)成分。同時(shí)，試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)丹酚酸B受熱易分解[8]，因此供試品處理后應(yīng)及時(shí)測(cè)定丹酚酸B含量，避免產(chǎn)生誤差。

中藥制劑的提取工藝正交試驗(yàn)多以干膏率為指標(biāo)，其方法多數(shù)參照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0831干燥失重測(cè)定法。本試驗(yàn)中正交試驗(yàn)起初也參照干燥失重測(cè)定法測(cè)定干膏率，然而難以達(dá)到藥典中“恒重”的標(biāo)準(zhǔn)。推測(cè)當(dāng)干膏率較高時(shí)，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)的加熱時(shí)間導(dǎo)致浸膏受熱面積不均勻，部分出現(xiàn)炭化，因此難以確保恒重。因此本試驗(yàn)參照2015年版《中國(guó)藥典（四部）》通則2201浸出物測(cè)定法，作為總固形物測(cè)定法。

由于丹參為本方君藥，且方中藥味較多，因此綜合評(píng)分權(quán)重比例中，丹酚酸B含量與總固形物質(zhì)量各占評(píng)分比重的50%。本研究選擇的指標(biāo)成分是參考2015年版《中國(guó)藥典》中藥材飲片的主要成分，其含量不能完全反映制劑的療效，故還需結(jié)合藥效和毒理試驗(yàn)，確定制劑主要療效成分及限定，確定更加科學(xué)的提取工藝。

3.3 研究?jī)r(jià)值

本研究中試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)便，優(yōu)選出的提取工藝穩(wěn)定性好，可為將肝纖方進(jìn)一步開(kāi)發(fā)成中藥制劑提供重要的試驗(yàn)參考。