曾 橋，張昊亮，夏 飛，胡 歆，樊 成，段 潔，毛濃武，米柱先

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西 西安 710021；3.咸陽涇渭茯茶有限公司，陜西 咸陽 712044；4.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710048)

0 引言

茯磚茶屬于后發(fā)酵茶，主要以黑毛茶為原料，經(jīng)原料篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發(fā)花、干燥、陳化等工藝制作而成.茯磚茶加工工藝復(fù)雜，生產(chǎn)歷史悠久，且具有內(nèi)質(zhì)金花普茂，開湯后湯色紅濃、菌香濃郁、香氣純正、滋味醇厚的獨(dú)特品質(zhì)[1].研究表明，茯磚茶含有茶多酚、生物堿、氨基酸、黃酮、多糖、茶色素等多種活性成分，具有健胃消食、降血壓、降血脂、抗氧化、保肝護(hù)肝、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等保健功能[2]，因而受到消費(fèi)者的青睞，成為近年來茶葉市場上的熱銷品種.目前，對于茯磚茶的研究主要集中于茯磚茶發(fā)花工藝、冠突散囊菌分類鑒定、活性成分提取分離及純化、保健功能及其機(jī)制研究等方面.

秀麗隱桿線蟲(以下簡稱線蟲)生命周期短，易于觀察與計(jì)數(shù)，與人類具有相似的衰老過程，且遺傳信息與信號通路相對保守，常被作為生物學(xué)研究的模式生物[3,4]，可以用于評價(jià)天然活性物質(zhì)抗氧化活性和延緩衰老作用.因此，本實(shí)驗(yàn)以秀麗隱桿線蟲為模型，探索了茯磚茶提取物對線蟲急性氧化應(yīng)激、壽命、抗氧化酶活力以及抗氧化基因表達(dá)水平的影響，以研究茯磚茶的抗氧化和延長壽命作用及其機(jī)制，從而為茯磚茶的科學(xué)飲用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯磚茶，以湖南安化天尖黑茶為原料，由陜西樸道茯茶股份有限公司加工制成茯磚茶.

野生型線蟲N2和大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)OP50，由陜西科技大學(xué)藥學(xué)系提供.

超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所.

30%雙氧水、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、膽固醇、無水乙醇、氫氧化鈉、胰蛋白胨、瓊脂粉、酵母抽提物、0.9%生理鹽水，均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

NGM培養(yǎng)基、M9緩沖液 ，按照參考文獻(xiàn)[5]稍作修改配制而成.

1.2 儀器與設(shè)備

Varioskan flash酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；TU-1810紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FA1004N電子分析天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；GH-420ASB隔水式恒溫培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 茯磚茶制備

取茯磚茶1塊(500 g)，掰開揉碎，混合均勻，稱取1 g，置于50 mL沸水中沖泡5 min后立即過濾，收集濾液并滅菌，待冷卻后用無菌水定容至50 mL，得濃度為20 mg/mL茯磚茶提取物母液.精密吸取茯磚茶提取物母液用無菌水配制成質(zhì)量濃度為200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯磚茶提取物工作液，喂食前經(jīng)0.22μm微孔膜過濾.

1.3.2 線蟲同期化培養(yǎng)

挑取20條處于產(chǎn)卵期的線蟲至涂E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基平板上，于20 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，取出平板，挑走線蟲，繼續(xù)將平板置于20 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，即得同期化線蟲.

1.3.3 氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

挑取同期化線蟲20±2條轉(zhuǎn)移到分別喂食含不同質(zhì)量濃度茯磚茶提取物100μL的NGM培養(yǎng)基中，其中每10 mL NGM培養(yǎng)基添加濃度30%的雙氧水10μL，每20 min挑出死亡線蟲并計(jì)數(shù)，直至線蟲全部死亡.每組實(shí)驗(yàn)3板，同時(shí)做空白，繪制線蟲存活時(shí)間曲線.

1.3.4 線蟲壽命測定

挑取同期化線蟲20±2條轉(zhuǎn)移到分別喂食質(zhì)量濃度為0μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯磚茶提取物100μL的NGM培養(yǎng)基中，置于20 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1 d觀察平板上線蟲生長情況，記錄死亡線蟲數(shù)量，并將死亡線蟲挑出.每2 d更換新鮮培養(yǎng)基，直至所有線蟲死亡，每組實(shí)驗(yàn)3板，計(jì)算線蟲平均壽命，并繪制壽命曲線.

1.3.5 線蟲體內(nèi)抗氧化酶活力測定

將同期化線蟲分別于含不同質(zhì)量濃度茯磚茶提取物100μL的NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，收集至EP管.加入1 mL磷酸鹽緩沖液(pH6.0)于3 000 r/min離心1 min，棄上清.進(jìn)一步加入滅菌后的生理鹽水洗滌，離心棄上清，重復(fù)3次.將經(jīng)生理鹽水洗滌后的線蟲置于研缽中，加入液氮至液面沒過樣品，待液氮揮發(fā)后，在研缽內(nèi)研磨樣品約2 min，待樣品融化后，繼續(xù)加入液氮，如此反復(fù)凍融3次，離心取上清液，按試劑盒說明書要求測定SOD、CAT活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.3.6 抗氧化基因表達(dá)水平測定

收集同期化線蟲，將同期化線蟲分別在空白培養(yǎng)基及400μg/mL茯磚茶提取物的NGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，用M9緩沖液將線蟲沖洗至EP管中，3 000 r/min離心1 min，棄上清.加滅菌生理鹽水，離心棄上清，重復(fù)洗滌3次，含線蟲懸液的EP管放入-80 ℃冰箱備用，并送往上海生工依次進(jìn)行線蟲RNA的提取、RNA純度及完整性的鑒定，合成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR監(jiān)測線蟲體內(nèi)相關(guān)抗氧化基因mRNA表達(dá)水平，以gpd-1為持家基因，分別監(jiān)測age-1,sir-2.1,sod-3,daf-16,ctl-1mRNA表達(dá).mRNA表達(dá)水平測定用PCR引物見表1所示.

表1 秀麗隱桿線蟲抗氧化基因mRNA表達(dá)水平測定用PCR引物[6]

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 茯磚茶提取物對H2O2損傷組線蟲的保護(hù)作用

研究表明，雙氧水在線蟲體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)會誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激[7].由圖1可以發(fā)現(xiàn)，相對于空白組，200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯磚茶提取物組線蟲平均存活率分別提高了19.65%、23.12%、11.56%、4.62%、1.73%，說明茯磚茶提取物對H2O2損傷組線蟲具有一定保護(hù)作用.

茯磚茶提取物中含有茶多酚、黃酮、多糖等抗氧化活性成分，一方面抗氧化活性成分對線蟲體內(nèi)與自由基的生成有關(guān)的酶如髓過氧化酶(MPO)、脂氧化酶和環(huán)氧酶等有抑制作用，另一方面抗氧化成分能夠防護(hù)體內(nèi)抗氧化酶和增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶活性，從而起到抗氧化作用，因此提高了線蟲氧化應(yīng)激能力[8].

從圖1還可以看出，茯磚茶提取物組對提高線蟲氧化應(yīng)激能力隨濃度的增加先上升后下降，飼喂400μg/mL茯磚茶提取物組效果最佳，這可能是由于茶葉中還含有咖啡因等[9]，提取物濃度過高對線蟲有一定毒害作用.

圖1 茯磚茶提取物對雙氧水損傷組線蟲的保護(hù)

2.2 茯磚茶提取物對線蟲壽命的影響

有研究表明，抗氧化被認(rèn)為是實(shí)現(xiàn)抗衰老的重要方法，呂振宇等[10]研究發(fā)現(xiàn)枸杞可以降低線粒體中O2-·的水平，主要在線粒體中發(fā)揮抗氧化作用.從圖2可以看出，與空白組相比，200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯磚茶提取物組平均壽命分別延長14.05%、19.82%、7.69%、5.33%、2.66%，說明一定質(zhì)量濃度的茯磚茶提取物能夠有效的延緩線蟲的衰老.實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，400μg/mL茯磚茶提取物組線蟲最高壽命可達(dá)22 d，而空白組線蟲最高壽命分別為18 d，最高壽命延長了22.2%，這和氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.

圖2 茯磚茶提取物對線蟲壽命影響

2.3 茯磚茶提取物對線蟲體內(nèi)主要抗氧化酶活力的影響

SOD是有效清除生物體內(nèi)活性氧的主要酶類之一，是抗氧化系統(tǒng)的第一道防線[11]，CAT也是清除生物細(xì)胞中活性氧的重要保護(hù)酶類，通過催化細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的過氧化氫，從而防止氧自由基的形成，因此，適當(dāng)增加生物體內(nèi)SOD和CAT含量有助于抗氧化和延長壽命.

從圖3可以看出，相對于空白組，飼喂200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯磚茶提取物線蟲體內(nèi)SOD酶活分別提高15.61%、23.31%、12.82%、4.87%和1.42% .從圖4可以看出，相對于空白組，飼喂200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL、800μg/mL、1 000μg/mL茯磚茶提取物線蟲體內(nèi)CAT酶活分別提高24.71%、38.29%、14.27%、5.26% 和4.12%.說明飼喂茯磚茶提取物可提高線蟲體內(nèi)SOD及CAT酶活力，且提高SOD及CAT酶活的能力隨濃度的增加先上升后下降，這和氧化應(yīng)激以及壽命實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相吻合.

圖3 茯磚茶提取物對線蟲體內(nèi)SOD活力的影響

圖4 茯磚茶提取物對線蟲體內(nèi)CAT酶活力的影響

2.4 茯磚茶提取物對線蟲抗氧化基因表達(dá)水平的影響

圖5反映了茯磚茶提取物對線蟲抗氧化基因表達(dá)水平的影響.從圖5可以看出，相對于空白組，經(jīng)茯磚茶提取物處理的線蟲體內(nèi)ctl-1、daf-16、sir-2.1和sod-3mRNA相對表達(dá)量均有不同程度的提高，而age-1mRNA表達(dá)水平呈下降趨勢.ctl-1、daf-16、sir-2.1和sod-3mRNA相對表達(dá)量分別提高44.5%、13.7%、22.5%和42.9%；age-1mRNA相對表達(dá)量下降5.4%.在秀麗隱桿線蟲中，許多基因發(fā)揮延長壽命的作用與daf-16轉(zhuǎn)錄因子的作用密切相關(guān)[12]，且已被daf-16缺陷型線蟲壽命實(shí)驗(yàn)證實(shí)[13].age-1是最早發(fā)現(xiàn)的與線蟲壽命有關(guān)的基因，是胰島素/類胰島素信號通路中抑制daf-16活性的關(guān)鍵因子，age-1mRNA表達(dá)水平的下降可降低對daf-16活性的抑制，而sir-2.1作為一種長壽基因，可以通過脫乙?；苯蛹せ頳af-16[6]，daf-16激活可以促進(jìn)sod-3及ctl-1的激活，從而延長線蟲壽命，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致.

圖5 茯磚茶提取物對線蟲相關(guān)基因相對表達(dá)影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用線蟲這一模式生物，以整體動物抗氧化和壽命實(shí)驗(yàn)作為檢測手段，研究茯磚茶提取物對線蟲抗氧化和壽命的影響.結(jié)果表明，飼喂茯磚茶提取物提高了線蟲體內(nèi)SOD及CAT酶活力，增強(qiáng)了線蟲氧化應(yīng)激能力，延長了線蟲壽命.抗氧化基因表達(dá)水平測定結(jié)果表明，飼喂茯磚茶提取物組可不同程度的提高線蟲體內(nèi)ctl-1、daf-16、sir-2.1和sod-3mRNA的表達(dá)水平，同時(shí)降低age-1mRNA表達(dá)水平，因而使得線蟲壽命得到延長.因此，飼喂茯磚茶提取物提高線蟲氧化應(yīng)激能力及壽命的機(jī)制可能在于茯磚茶提取物增強(qiáng)了線蟲體內(nèi)抗氧化酶活性同時(shí)調(diào)節(jié)抗氧化基因表達(dá)水平，這為科學(xué)飲用茯磚茶提供了參考.