羅南友，陳明友

(隆昌市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川內(nèi)江 642150)

缺血性腦卒中(IS)是腦卒中中最為常見(jiàn)的一類(lèi)，占60%～70%[1-2]。近年來(lái)，微小RNA與心血管病之間關(guān)系的研究逐漸增多。其中，微小RNA-497 (miR-497)被證實(shí)能夠通過(guò)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、炎癥和血管生成等過(guò)程的調(diào)控在IS病變中發(fā)揮作用[3]。Toll-樣受體4(TLR4)是參與機(jī)體天然免疫的重要炎癥分子，其可以誘導(dǎo)促炎癥基因、炎性細(xì)胞因子等的表達(dá)，并在血管內(nèi)皮炎癥損害中發(fā)揮作用[4]。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)同樣具有血管特異性的炎癥標(biāo)志物，已被證實(shí)是心血管疾病的危險(xiǎn)因素[5]。本研究通過(guò)比較IS患者、出血性腦卒中與健康人群血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平，旨在探究三者對(duì)IS的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集本院2016年6月到2017年12月確診的IS患者160例作為IS組，其中男103例，女57例，平均年齡為(60.2±6.1)歲。IS患者均符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南(2014)》[6]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為首次發(fā)病且經(jīng)計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)或核磁共振成像(MRI)檢查證實(shí)。所有患者于入院后依據(jù)國(guó)立衛(wèi)生院卒中量表(NIHSS)進(jìn)行評(píng)分[7]。選取出血性腦卒中患者80例作為出血性腦卒中組，其中男47例，女33例，平均年齡為(57.8±6.3)歲。出血性腦卒中患者均符合《中國(guó)腦梗死中西醫(yī)結(jié)合診治指南(2017)》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。同期納入前來(lái)本院體檢中心體檢的健康者160例作為健康對(duì)照組，其中男99例，女61例，平均年齡為(58.9±5.6)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往有其他心腦血管疾病史者；(2)排除老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病導(dǎo)致的無(wú)法采集相關(guān)信息和精神分裂癥的患者；(3)急性或慢性感染或炎癥性疾病。從患者入院開(kāi)始對(duì)納入的160例IS患者進(jìn)行6個(gè)月的電話隨訪。本研究的開(kāi)展經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2樣本例數(shù)計(jì)算 診斷試驗(yàn)樣本例數(shù)計(jì)算公式為n=(μα2/δ)2(1-P)P，其中α定為0.05，則μα為1.96；δ一般定在0.10；P值的確定：P靈敏度=90%。將μα=1.96，δ=0.10，P靈敏度=90%代入公式計(jì)算后可得病例數(shù)n≈133例，即本研究需要至少133例患者。本次研究共納入160例患者，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求。

1.3臨床資料與樣本采集 由研究人員對(duì)研究對(duì)象的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥(空腹膽固醇大于240 mg/dL)等基本資料進(jìn)行采集，BMI計(jì)算公式為：體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)。采用促凝采血管采集IS患者、出血性腦卒中患者(入院48 h內(nèi)采集)與健康體檢者外周靜脈血2 mL，并于2 h內(nèi)分離血清后放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z測(cè)。

1.5血清miR-497表達(dá)水平檢測(cè) 按照血清RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行總RNA提取。取上述提取的RNA，使用去除基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)，儀器為CFX96(美國(guó)Bio-Rad公司)。RT-PCR按照SYBR GREEN說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反應(yīng)體系為：Mix 10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水6.4 μL。qPCR循環(huán)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。使用的miR-497與甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-497的相對(duì)表達(dá)量。

表1 miR-497和GAPDH的引物序列

2 結(jié) 果

2.1研究對(duì)象基本信息比較 3組間在年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥和BMI比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 研究對(duì)象基本信息比較

注：-表示無(wú)數(shù)據(jù)

2.23組研究對(duì)象血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平比較 血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2檢測(cè)的批內(nèi)CV值分別為2.4%、2.9%和2.2%，批間CV值分別為2.6%、3.7%和2.8%，均小于5.0%，提示實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有良好的重復(fù)性和精確度。與出血性腦卒中組和健康對(duì)照組相比，IS組患者血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平顯著升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.3血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平與IS臨床特征間的關(guān)系 血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平與IS患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高膽固醇血癥和BMI等因素均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平與IS患者NIHSS評(píng)分(miR-497：r=0.545，P=0.001；TLR4：r=0.538，P=0.002；Lp-PLA2：r=0.566，P=0.001)呈正相關(guān)，見(jiàn)表4。

表3 各組研究對(duì)象血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平比較

注：與出血性腦卒中組相比，*P<0.05；與健康對(duì)照組相比，#P<0.05

表4 血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平與IS臨床特征的關(guān)系(n=160)

續(xù)表4 血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平與IS臨床特征的關(guān)系(n=160)

注：1表示聯(lián)合檢測(cè);2表示miR-497;3表示Lp-PLA2;4表示TLR4;5表示參考線

圖1各指標(biāo)單一檢測(cè)及并聯(lián)檢測(cè)鑒別IS的ROC曲線分析

2.4血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2鑒別IS的ROC曲線分析 血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2區(qū)分IS組患者與出血性腦卒中組和健康對(duì)照組的AUC分別為：0.904(95%CI：0.833～0.977，P<0.05)、0.764(95%CI：0.688～0.887，P<0.05)和0.844(95%CI：0.800～0.929，P<0.05)；對(duì)應(yīng)的靈敏度及特異度分別為78.3%、94.8%，77.0%、78.5%和70.8%、92.8%；對(duì)應(yīng)的臨界值分別為16.6、32.2 mIU/mL和214.5 μg/L。當(dāng)聯(lián)合血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2時(shí)，3種指標(biāo)在區(qū)分IS組與出血性腦卒中組和健康對(duì)照組的AUC為0.975(95%CI：0.932～0.998，P<0.05)，靈敏度為94.2%，特異度為74.3%，見(jiàn)圖1。

2.5血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平對(duì)IS患者的生存分析和Cox比例回歸模型分析 截至隨訪完成，160例IS患者中死亡38例，無(wú)患者失訪。IS患者依據(jù)miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平的中位數(shù)[miR-497：30.8(-log)；TLR4：318.6 μg/L；Lp-PLA2：40.1 mIU/mL]分別被分為高miR-497與低miR-497組、高TLR4與低TLR4組和高Lp-PLA2與低Lp-PLA2組。相比低miR-497組，高miR-497組患者的生存時(shí)間顯著縮短(χ2=8.405，P=0.004)，見(jiàn)圖2A；相比低TLR4組，高TLR4組患者的生存時(shí)間顯著縮短(χ2=5.171，P=0.023)，見(jiàn)圖2B；相比低Lp-PLA2組，高Lp-PLA2組患者的生存時(shí)間顯著縮短(χ2=11.417，P=0.001)，見(jiàn)圖2C。Cox比例回歸模型分析結(jié)果提示，高miR-497、高TLR4、高Lp-PLA2和高血壓等因素均是提高IS患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的重要因素；而年齡、性別、吸煙史、飲酒史、糖尿病、高膽固醇血癥和BMI等因素不能顯著提高IS患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，見(jiàn)表5。

注：A為高miR-497與低miR-497組；B為高TLR4與低TLR4組；C為高Lp-PLA2與低Lp-PLA2組

圖2血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2水平與IS患者的生存分析

表5 影響IS患者生存的Cox比例回歸模型分析

3 討 論

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明miR-497和心肌梗死、視網(wǎng)膜病炎性病變等關(guān)系密切[9-10]。LI[10]發(fā)現(xiàn)miR-497表達(dá)水平的增高可以促進(jìn)微血管炎性反應(yīng)等的發(fā)生，而降低miR-497的表達(dá)可提高視覺(jué)功能并能降低糖尿病誘導(dǎo)的促炎癥蛋白的表達(dá)，從而減輕視網(wǎng)膜血管的損傷。進(jìn)一步的研究證實(shí)，miR-497可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)p53的水平發(fā)揮細(xì)胞毒性功能，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子磷脂酶A2-IVA的作用，提高磷脂酶A2-IVA的表達(dá)水平，促進(jìn)炎癥因子的釋放[3]。血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥導(dǎo)致的動(dòng)脈粥樣斑塊形成是IS的重要病理基礎(chǔ)，本研究通過(guò)臨床樣本檢測(cè)出IS患者高水平血清miR-497的表達(dá)，且與患者NIHSS評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.545,P=0.001)，與前期的基礎(chǔ)研究結(jié)果相一致[3,9-10]。這些研究表明，IS患者血清中miR-497水平的增高可能參與了機(jī)體的炎性反應(yīng)。

Lp-PLA2又稱(chēng)血小板活化因子乙酰水解酶，主要由成熟的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)行合成和分泌，是磷脂酶超家族的一員。Lp-PLA2能夠有效使血小板活化因子水解和喪失活性，同時(shí)可以水解氧化卵磷脂并促進(jìn)并介導(dǎo)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起大量的單核細(xì)胞浸潤(rùn)，繼而增強(qiáng)粥樣硬化的形成和降低粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[11-12]。本研究結(jié)果表明，與健康對(duì)照組相比，IS患者血清Lp-PLA2水平顯著上升，且與NIHSS評(píng)分相關(guān)。主要是因?yàn)榛颊叱霈F(xiàn)IS后，Lp-PLA2參與了動(dòng)脈粥樣硬化的主要形成過(guò)程，腦梗死后腦脊液中Lp-PLA2的通過(guò)血腦屏障進(jìn)入血清，導(dǎo)致血清Lp-PLA2水平升高。此外，腦梗死可導(dǎo)致急性腦水腫，顱內(nèi)壓增高，通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂機(jī)制使腎功能異常，血管緊張素和抗利尿激素分泌增加，腎小球?yàn)V過(guò)率降低，血液中Lp-PLA2清除率降低，是造成血清Lp-PLA2水平增高的另一個(gè)重要原因。

TLR4是參與機(jī)體天然免疫的重要炎癥分子，同時(shí)他也是連接天然免疫與特異性免疫的重要物質(zhì)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TLR4可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IL-12、IL-8、IL-23 等可溶性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子可促進(jìn)T輔助細(xì)胞參與機(jī)體的細(xì)胞核體液免疫應(yīng)答[13]。此外，TLR4還可以誘導(dǎo)促炎癥基因、炎性細(xì)胞因子等的表達(dá)，并在血管內(nèi)皮炎癥損害中發(fā)揮作用[14]。血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥與氧化應(yīng)激是動(dòng)脈粥樣斑塊形成重要的發(fā)生基礎(chǔ)。早前報(bào)道也指出，IS患者體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞處于高炎癥狀態(tài)。本研究通過(guò)臨床樣本檢測(cè)出IS患者高水平血清TLR4的表達(dá)，與前期的基礎(chǔ)研究結(jié)果相呼應(yīng)[13-14]。

ROC曲線分析顯示，血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2區(qū)分IS組與出血性腦卒中組和健康對(duì)照組時(shí)具有一定的價(jià)值，當(dāng)聯(lián)合miR-497、TLR4及Lp-PLA2等指標(biāo)時(shí)在區(qū)分IS組患者與出血性腦卒中組和健康對(duì)照組的靈敏度達(dá)到94.2%，提示聯(lián)合上述3種標(biāo)志物具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。進(jìn)一步的生存分析也提示，高miR-497、高TLR4與高Lp-PLA2水平患者的預(yù)后較低水平者更差，Cox比例回歸模型分析結(jié)果提示，高miR-497、高TLR4、高Lp-PLA2和高血壓等因素均是提高IS患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的重要因素。上述研究提示，血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2在IS診斷及預(yù)后警示中具有重要臨床價(jià)值。然而，本研究仍有如下不足：(1)本研究納入160例IS患者，病例數(shù)仍然有限，后期需要更大樣本量的研究來(lái)證實(shí)血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2在我國(guó)IS患者中的臨床價(jià)值；(2)本研究中采用的miR-497、TLR4及Lp-PLA2多個(gè)指標(biāo)的聯(lián)合模型雖然較各單獨(dú)指標(biāo)有較高的臨床價(jià)值，但該模型的應(yīng)用仍有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-497、TLR4及Lp-PLA2對(duì)IS具有潛在的診斷及預(yù)后價(jià)值，聯(lián)合應(yīng)用這3個(gè)指標(biāo)有望成為IS臨床診療的途徑。