劉沃滿，唐玉芬△，黎洛冰，聶俊瑋，譚滿勝

(茂名市婦幼保健院：1.遺傳優(yōu)生優(yōu)育中心；2.產(chǎn)前診斷中心，廣東茂名 525000)

染色體非整倍體異常是一種常見(jiàn)的染色體數(shù)目異常，其中以三體型和單體型最為常見(jiàn)。最常見(jiàn)的染色體數(shù)目異常包括21三體綜合征、18三體綜合征、13三體綜合征、三倍體和性染色體數(shù)目異常，如Klinefelter綜合征(47，XXY)、Jacobs綜合征(47，XXX)、XYY綜合征(47，XYY)和Turner綜合征(45，X),約占產(chǎn)前診斷中有臨床意義染色體異常的80%[1]。這些疾病在胎兒期常表現(xiàn)為宮內(nèi)死胎、流產(chǎn)等。出生后臨床可表現(xiàn)為不同程度的智力低下、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、性發(fā)育不良和其他組織器官畸形等，患者多數(shù)生活上不能自理，這給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。染色體異常目前還沒(méi)有有效的治療方法，僅能通過(guò)產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷干預(yù)患兒的出生，提高新生兒的質(zhì)量。染色體核型分析是目前診斷染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的金標(biāo)準(zhǔn)，但因?yàn)槭菍?duì)活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)環(huán)境條件和人員的要求比較高，而且以手工操作為主，耗時(shí)長(zhǎng)，造成孕婦及其家屬等待核型分析結(jié)果的焦慮。熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QF-PCR)技術(shù)是近年發(fā)展的一種快速診斷染色體非整倍體的分子生物學(xué)方法，目前已廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外多家產(chǎn)前診機(jī)構(gòu)[2-7]。本研究是應(yīng)用QF-PCR技術(shù)和核型分析兩種方法對(duì)3 398例胎兒樣本進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 87例絨毛、219例臍帶血和3 092例羊水標(biāo)本來(lái)自于2016年3月至2018年12月本院產(chǎn)前診斷中心就診的3 398例高危孕婦，風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)主要包括孕婦高齡、唐篩高風(fēng)險(xiǎn)、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)、胎兒超聲異常、夫婦雙方患有珠蛋白生成障礙性貧血(簡(jiǎn)稱地貧)、不良生育史和染色體異常家族史，孕周為7～25周。

1.2標(biāo)本采集 孕婦在本院產(chǎn)前診斷中心咨詢并簽署知情同意書(shū)，根據(jù)孕周的不同，在B超引導(dǎo)下進(jìn)行絨毛或羊水或臍血穿刺取樣后，同時(shí)進(jìn)行染色體核型分析及QF-PCR檢測(cè)。

1.3染色體核型分析 按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)、收獲、制片G顯帶，參照人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名的國(guó)際體制(2013年)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析。

1.4QF-PCR檢測(cè)方法

1.4.1STR位點(diǎn) 采用北京閱微基因技術(shù)有限公司的非整倍體檢測(cè)試劑盒對(duì)常見(jiàn)21、18、13及性染色體非整倍體進(jìn)行檢測(cè)。共檢測(cè)27個(gè)位點(diǎn)，包括21號(hào)染色體的8個(gè)STR位點(diǎn)，分別為D21S2052、D21S1411、D21S1446、LFG21、D21S1435、D21S11、D21S1246、Penta D；18號(hào)染色體的6個(gè)STR位點(diǎn)，分別為D18S51、D18S535、D18S1002、D18S877、D18S851、D18S391；13號(hào)染色體的6個(gè)STR位點(diǎn)，分別為D13S256、D13S797、D13S317、D13S305、D13S800、D13S325；性染色體的7個(gè)STR位點(diǎn)，分別為DXS6809、DXS9895、AMEL、TAF9L(3號(hào)染色體和X染色體)、ZFXY、SRY、XHPRT。

1.4.2標(biāo)本DNA的提取 按Chelex-100法[8]提取臍血、羊水、絨毛等標(biāo)本的DNA。

1.4.3PCR擴(kuò)增 在Bio-Rad T100型PCR擴(kuò)增儀上擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性，然后 94 ℃ 30 s、60 ℃ 1 min、70 ℃ 1 min，循環(huán) 27 次，再60 ℃延伸 60 min，最后擴(kuò)增產(chǎn)物于 4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4毛細(xì)管電泳 取甲酰胺8.5 μL，分子質(zhì)量標(biāo)記物0.5 μL，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 1.0 μL，于95 ℃變性 3 min，放置冰上迅速冰冷 3 min，用 ABI 3500 Dx 型遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.4.5結(jié)果分析及判斷標(biāo)準(zhǔn) 采用GeneMapper?ID-X軟件對(duì)電泳原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。參照英國(guó)臨床分子遺傳協(xié)會(huì)(CMGS)2012年新頒布的指南進(jìn)行分析。(1)雙峰比值為0.8～1.4視為正常；當(dāng)峰標(biāo)記長(zhǎng)度大于或等于24 bp時(shí)，峰高度或面積比值達(dá)1.5時(shí)也可視為正常。(2)三峰比值為1∶1∶1及雙峰比值為2∶1(1.8～2.4)或1∶2(0.45～0.65)視為異常；(3)當(dāng)雙峰比值在1.4～1.8或0.65～0.80時(shí)，需要對(duì)該樣本進(jìn)行重測(cè)。(4)單峰一般為純合，不能提供診斷信息。45，X診斷的標(biāo)準(zhǔn)必須具備以下兩個(gè)條件:(1)所有X染色體STR位點(diǎn)呈單峰；(2)TAF9L基因座上的兩個(gè)峰高比為2∶1(1.8～2.4)。

2 結(jié) 果

2.1兩種方法的檢測(cè)結(jié)果比較 應(yīng)用QF-PCR方法成功檢測(cè)3 398例樣本，共檢出非嵌合型染色體數(shù)目異常152例，見(jiàn)表1。其中21三體綜合征92例，18三體綜合征30例，13三體綜合征6例，X單體 6例，XXX 1例，XXY 11例，XYY 5例，XXX合并18三體綜合征1例，上述檢測(cè)結(jié)果與核型分析結(jié)果一致。嵌合型染色體數(shù)目異常7例，QF-PCR檢出3例，分別是1例18三體綜合征嵌合體，1例21三體綜合征嵌合體，1例XXX與XX嵌合體，還有4例嵌合體QF-PCR未能檢出。另外，有2例QF-PCR結(jié)果與核型分析結(jié)果不符。1例QF-PCR結(jié)果為XYY，染色體核型結(jié)果為46，X，?der(Y),另1例QF-PCR結(jié)果為XY，染色體核型結(jié)果為45，X。

表1 QF-PCR檢測(cè)的5種染色體非整倍體結(jié)果與核型分析結(jié)果

2.2其他染色體核型分析異常結(jié)果 共檢出其他染色體核型分析異常100例，包括染色體易位65例、倒位14例、缺失7例的結(jié)構(gòu)異常和其他染色體數(shù)目異常14例，因不在QF-PCR檢測(cè)范圍內(nèi)，未能檢測(cè)到。

2.3檢出1例雙三體 在3 398例胎兒樣本中，發(fā)現(xiàn)1例XXX合并18三體綜合征的雙三體，核型結(jié)果為48，XXX,+18見(jiàn)圖1、2。

圖1 XXX,+18 QF-PCR檢測(cè)結(jié)果圖

圖2 48,XXX,+18的核型分析結(jié)果

2.4產(chǎn)前地貧基因診斷同時(shí)進(jìn)行QF-PCR檢測(cè)的結(jié)果 患有地貧的夫婦雙方進(jìn)行產(chǎn)前地貧基因診斷的1 041個(gè)家庭，同時(shí)進(jìn)行了QF-PCR檢測(cè)，地貧基因產(chǎn)前診斷結(jié)果為輕型或正常，而QF-PCR則檢出2例21三體綜合征，1例XXY染色體非整倍體異常胎兒。

3 討 論

QF-PCR檢測(cè)是利用STR遺傳標(biāo)記在人群中的多態(tài)性，采用多重PCR擴(kuò)增及毛細(xì)管電泳技術(shù)，通過(guò)分析各STR點(diǎn)熒光峰的個(gè)量或面積的比值從而達(dá)到判斷染色體數(shù)目[9]。QF-PCR技術(shù)與G顯帶的核型分析方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)快速。核型分析方法因需要對(duì)胎兒活細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，至少要2～3周才能出結(jié)果，而QF-PCR可在24～48 h內(nèi)得出結(jié)果，大大縮短了報(bào)告時(shí)間，減輕了孕婦在等待報(bào)告過(guò)程中產(chǎn)生的心理負(fù)擔(dān)和焦慮；(2)所需的樣本量少，可以同時(shí)進(jìn)行單基因病的診斷；(3)操作簡(jiǎn)便、自動(dòng)化程度高、通量大；(4) 可以根據(jù)STR等位基因的個(gè)性化信息判別多余染色體的來(lái)源，鑒別母體組織污染。但是QF-PCR技術(shù)仍存在以下不足：(1)目前QF-PCR只能檢測(cè)13、18、21、X及Y這5條染色體的數(shù)目異常，對(duì)其他染色體數(shù)目異常無(wú)法檢出;(2)對(duì)比例低的嵌合體異常無(wú)法檢出;(3)不能診斷染色體結(jié)構(gòu)異常。

本報(bào)道中的3 398例產(chǎn)前標(biāo)本采用QF-PCR技術(shù)檢測(cè)，均在24～48 h內(nèi)成功得出結(jié)果。共檢出非嵌合型13、18、21、X及Y 5種染色體數(shù)目異常152例，與核型分析結(jié)果一致，說(shuō)明QF-PCR技術(shù)檢測(cè)常見(jiàn)5種染色體非整倍體有較高的特異度和靈敏度，與文獻(xiàn)報(bào)道相符[10]。用QF-PCR方法是檢測(cè)不到的嵌合比例低于15%～20% 的嵌合體[11]，本研究中的7例嵌合體檢出3例，嵌合比例都大于30%。1例QF-PCR結(jié)果為XYY，而染色體核型結(jié)果為46，X，?der(Y)。疑是2個(gè)Y染色體在著絲粒連接成一個(gè)衍生的Y染色體。1例QF-PCR結(jié)果為XY，染色體核型結(jié)果為45，X，未檢出Y染色體。可能是含有Y基因的Y片段易位至X染色體或其他常染色體上，其社會(huì)性別將表現(xiàn)為男性，但未能有生育能力[12]。檢出1例X三體加18三體綜合征的雙三體。雙三體是少見(jiàn)的染色體數(shù)目異常。非整倍體的發(fā)生機(jī)制是由于生殖細(xì)胞分裂過(guò)程中同源染色體不分離所造成,且多發(fā)生于第一次減數(shù)分裂時(shí),其結(jié)果形成三體性或單體性異常。雙三體則由于雙原發(fā)不分離所造成[13]。在18三體綜合征中雙三體病例占5%～10%[13]。

廣東省為地貧高發(fā)區(qū)，在某些地區(qū)地貧基因攜帶率可高達(dá)16.83%[14]。中重度地貧患兒的出生會(huì)給家庭和社會(huì)造成巨大疾病和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前通過(guò)采取婚前、孕前檢查，以及產(chǎn)前篩查和診斷等防控措施，可減少重型地貧兒的出生。在進(jìn)行產(chǎn)前地貧基因診斷的同時(shí)進(jìn)行QF-PCR檢測(cè)常見(jiàn)染色體數(shù)目異常，不增加所取的樣本量，就可以避免缺陷兒的出生。在本報(bào)道中的患有地貧的夫婦雙方進(jìn)行產(chǎn)前地貧基因診斷的1 041個(gè)家庭，檢出2例21三體綜合征，1例XXY，及時(shí)終止妊娠，避免了染色體異常胎兒的出生。

4 結(jié) 論

QF-PCR技術(shù)用于診斷產(chǎn)前染色體非嵌合型非整倍體如13、18、21、X及Y異常，具有快速，準(zhǔn)確、通量大和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，避免了孕婦及家屬長(zhǎng)時(shí)間等待核型分析結(jié)果的焦慮,也避免了延至妊娠后期流產(chǎn)對(duì)孕婦身體造成較大的創(chuàng)傷。但QF-PCR技術(shù)目前只能檢出5種常見(jiàn)染色體的數(shù)目異常,不能檢出染色體結(jié)構(gòu)異常和其他染色體數(shù)目異常。 因此，QF-PCR技術(shù)同其他快速產(chǎn)前診斷技術(shù)一樣,不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的G顯帶核型分析，僅可作為核型分析的一種有力補(bǔ)充。