徐高青，李志強，王友元，王 軍，呂文發(fā)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林省反芻動物繁育生物技術(shù)與健康養(yǎng)殖工程實驗室，吉林長春 130118）

褪黑素（N-乙?；?5-甲氧基色胺，Melatonin）是一種主要由松果體合成的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，能夠維持哺乳動物的晝夜節(jié)律[1-2]。褪黑素參與多種生理功能，包括抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、血管舒縮和癌癥預(yù)防[3-5]。睪丸間質(zhì)細胞是產(chǎn)生雄性激素的主要細胞，在精子發(fā)生和成熟過程中發(fā)揮著重要作用[6]。睪丸間質(zhì)細胞的凋亡與睪丸功能息息相關(guān)，睪丸間質(zhì)細胞缺乏會使生精細胞大量凋亡，從而導(dǎo)致睪丸生精功能障礙[7]。研究表明，在小鼠睪丸內(nèi)注射褪黑素抑制了睪酮的合成和分泌，同時顯著降低了小鼠睪丸間質(zhì)細胞分泌的睪酮水平以及睪酮合成關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因STAR、P450SCC（CYP11A1）和3β-HSD的表達水平[8-9]，但其對小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡的影響尚不清楚。本實驗在小鼠睪丸間質(zhì)細胞培養(yǎng)過程中添加不同濃度褪黑素，利用MTT 法檢測細胞活力，細胞流式術(shù)檢測細胞凋亡率，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白印跡（Western Blot）技術(shù)檢測凋亡相關(guān)基因BAX、BCL-2表達水平，從而分析褪黑素對小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及處理 實驗選擇小鼠睪丸間質(zhì)細胞系（TM3，武漢普諾賽生命科技有限公司，CL-0234）作為研究對象。配制含有5%胎牛血清、2.5%馬血清和1%青霉素/鏈霉素的細胞培養(yǎng)液用于細胞的體外培養(yǎng)。在處理細胞時，為消除血清的強烈刺激，換用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，在對照組中直接加入培養(yǎng)液，不同濃度處理組中分別在培養(yǎng)液中加入1、10、100、1 000 ng/mL 的褪黑素（SIGMA，M5250-1G），培養(yǎng)36 h 后，進行后續(xù)實驗。

1.2 MTT 法檢測細胞活力 將TM3 細胞傳代至96 孔板，用不同濃度褪黑素處理36 h 后，使用MTT 法檢測細胞活力。每孔加入MTT 試劑（BioFroxx，3580MG250）20 μL；37℃孵育4 h 后，棄上清，加入150 μL DMSO（二甲基亞砜），振蕩至藍紫色結(jié)晶完全溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在吸光度490 nm 處檢測細胞活力，選擇最佳處理時間點。

1.3 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 按照凋亡檢測試劑盒（BD Pharmingen，556547）要求，將處理好的細胞用PBS 清洗后，使用胰酶消化，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，再次使用PBS 緩沖液清洗2～3 次，加入200 μL 1×Binding Buffer、PI 和FITC 各5 μL，充分混勻，37℃孵育15 min，再加入200 μL 1×Binding Buffer，過膜至流式管中，在1 h 內(nèi)使用流式細胞儀檢測。

1.4 實時熒光定量PCR 檢測 使用RNAiso Plus（TaKaRa，9109）進行RNA 提取，根據(jù)TaKaRa 反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。本實驗所用基因引物由上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計及合成，引物序列見表1。利用熒光定量PCR 儀檢測對照組和不同濃度褪黑素處理組凋亡相關(guān)基因及增殖相關(guān)基因表達。20 μL 反應(yīng)體 系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、上游引物 0.4 μL（0.2 μmol/L）、下游引物 0.4 μL（0.2 μmol/L）、ROX reference Dye Ⅱ 0.4 μL、cDNA 2 μL，ddH2O 補足至 20 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，59℃退火34 s，擴增40 個循環(huán)，95℃復(fù)性15 s。運用 2-△△Ct方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 Western Blot 收集處理后的細胞，加入蛋白裂解液進行總蛋白提取，根據(jù)BCA 試劑盒說明書（碧云天）進行蛋白濃度檢測。配制15%聚丙烯酰胺凝膠，上樣進行電泳，采用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件0.12 A 28 min。采用BSA 封閉1.5 h，1∶1 000 加入一抗，即兔抗BAX（abclonal，A12009）和BCL-2（abclonal，A11025），4 ℃孵育過夜，TBST 洗3 次，每次5 min。1∶10 000二抗（羊抗兔IgG）室溫孵育1 h，TBST 洗3 次，每次5 min。最后用ECL 發(fā)光液顯影，用Tanon Gis 軟件進行灰度值分析，β-actin作為內(nèi)參。

表1 基因引物

1.6 統(tǒng)計分析 所有實驗均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，采用GraphPad Prism 軟件進行單因素方差分析，比較組間差異性，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素對小鼠睪丸間質(zhì)細胞活力的影響 如圖1 所示，與對照組相比，10 ng/mL（P＜0.01）和100 ng/mL（P＜0.05）褪黑素均提高了小鼠睪丸間質(zhì)細胞活力，1 000 ng/mL 褪黑素處理后，細胞活力無顯著性改變。

2.2 褪黑素對小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡率的影響 如圖2所示，與對照組相比，10 ng/mL 褪黑素處理后，細胞凋亡率極顯著下降（P＜0.01）；100 ng/mL 褪黑素處理后細胞凋亡率顯著下降（P＜0.05）。1 ng/mL 和1 000 ng/mL褪黑素處理后細胞凋亡率與對照組差異不顯著。

圖1 小鼠睪丸間質(zhì)細胞活力

圖2 小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡率

2.3 褪黑素對小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡相關(guān)基因的影響由圖3 可知，與對照組相比，10 ng/mL 褪黑素下調(diào)了促凋亡基因BAXmRNA 表達水平（P＜0.01），上調(diào)了抑凋亡基因BCL-2mRNA 表達水平（P＜0.01）。

圖3 凋亡相關(guān)基因BAX、BCL-2 mRNA 表達量

2.4 褪黑素對小鼠睪丸間質(zhì)細胞BAX 和BCL-2 蛋白表達的影響 如圖4 所示，10 ng/mL 褪黑素下調(diào)了BAX蛋白表達水平（P＜0.01），上調(diào)了BCL-2 蛋白表達水平（P＜0.01）。

圖4 凋亡相關(guān)蛋白BAX、BCL-2 表達水平

3 討 論

睪丸間質(zhì)細胞是睪丸中最重要的細胞之一，對精子的發(fā)生和睪丸發(fā)育具有重要作用。研究表明，睪丸間質(zhì)細胞的凋亡嚴重影響動物的繁殖性能[2]。近年來，褪黑素的抗凋亡作用已經(jīng)在多種細胞中被證明，但在睪丸間質(zhì)細胞中的研究較少。本實驗結(jié)果顯示，褪黑素可降低小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡，對細胞具有保護作用，這與實驗室前期在雞睪丸間質(zhì)細胞中的研究結(jié)果一致[10]。相關(guān)研究表明，褪黑素能夠通過其受體MT1 和MT2 抑制牛卵巢顆粒細胞凋亡，并且可緩解由β-玉米赤霉烯醇和HT-2 毒素誘導(dǎo)的細胞凋亡和氧化應(yīng)激[11-12]。Ma 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素降低了小鼠心肌細胞的凋亡水平以及血清肌酸磷酸激酶和乳酸脫氫酶的分泌水平，上調(diào)SIRT1和抑凋亡基因BCL-2表達，并下調(diào)促凋亡基因BAX、Caspase-3的表達。在化療實驗中，褪黑素能夠降低睪丸細胞凋亡，對精子具有保護作用[14]。

對于褪黑素的抗凋亡機制，目前已有研究表明，褪黑素可通過Nrf2 信號通路來發(fā)揮作用，提高線粒體膜電位（MMP）和BCL-2mRNA 和蛋白表達，降低Caspase-3 活性和促凋亡基因表達，減輕氯化鋁誘導(dǎo)的大鼠脾脹細胞凋亡[15]。此外，褪黑素還通過上調(diào)SIRT1表達，并促進細胞自噬，從而降低終板軟骨細胞的凋亡和鈣化[16]。

綜上所述，褪黑素能夠影響細胞的凋亡水平，從而調(diào)節(jié)動物機體的生理過程。本研究結(jié)果表明，褪黑素能夠提高小鼠睪丸間質(zhì)細胞活力，上調(diào)抑凋亡基因BCL-2mRNA 和蛋白表達，下調(diào)促凋亡基因BAXmRNA 和蛋白表達，抑制小鼠睪丸間質(zhì)細胞凋亡，但其抗凋亡機理尚不明確，還需要進一步研究。