楊方方，劉 萍，程 靜，彭偲偲，雷 亮，吳 濤，宋紅萍,

肝細胞依靠細胞膜上的藥物轉運體實現攝取和分泌膽汁的功能。在病理狀態(tài)下，肝細胞藥物轉運體發(fā)生顯著改變，參與誘導膽汁淤積性肝病發(fā)生[1]。膽管側膜ABC轉運體(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)表達異常、功能下降是膽汁淤積性肝病的重要分子基礎[2]。PDZK1(NHERF3)蛋白能夠調控多種藥物轉運體的表達和功能[3]。近年來發(fā)現，PDZK1表達抑制或者缺失，可以導致其靶蛋白(轉運體)的亞細胞定位異常、表達和功能下降。該研究篩選PDZK1基因的RNA最佳干擾靶點，構建其慢病毒干擾載體LV3/PDZK1 shRNA，體外觀測慢病毒介導的shRNA對BRL-3A細胞PDZK1的沉默效應及對膽管側膜膽鹽輸出泵(Bsep)表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料BRL-3A細胞株購自ATCC；3個干擾靶點寡核苷酸序列及其對照序列的合成由武漢塞維爾生物提供；質粒抽提試劑盒購自Roche公司；限制性內切酶、DNA內切酶、DNA連接酶和Taq聚合酶購自加拿大MBI Fermentas；中量抽提試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司；凝膠回收試劑盒購自北京天根生化公司；LV3 (H1/GFP&Puro)慢病毒載體購自上海吉瑪公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；PDZK1、Bsep抗體購自英國Abcam公司；最佳干擾靶點DNA oligo使用Designer 3.0(Genepharma)軟件進行設計，合成引物由蘇州吉瑪基因提供。

1.2 方法

1.2.1PDZK1最佳siRNA靶點的設計與篩選 分別針對3個靶點設計干擾大鼠PDZK1的siRNA序列(914、797、1 075)；以5×104個細胞/孔的細胞密度接種BRL-3A細胞在6孔板中，24 h后，分別以3對siRNA轉染細胞6 h后換液，48 h后采用RT-PCR和Western blot方法檢測PDZK1表達，篩選出最佳的RNA干擾靶點。大鼠PDZK1引物序列 F:5′-CTACGGTTTCTATCTGAGGGCG-3′，R:5′-AGGCAG TTCTTGACTTTGGCAG-3′；Bsep引物序列F:5′-CC CTCATACGGAATCCCAAGA-3′，R:5′-GGCGATGGG CAACTGAGAT-3′；β-actin引物序列F:5′-TGCTATG TTGCCCTAGACTTCG-3′，R:5′-GTTGGCATAGAGGTC TTTACGG-3′。

1.2.2PDZK1shRNA慢病毒載體的構建與鑒定 設計并合成針對最佳siRNA的shRNA靶序列；LV3-shRNA模板中的loop結構選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號；正義鏈模板的5′端添加了GATCC，與BamH Ⅰ酶切后形成的粘端互補；反義鏈模板的5′端添加了AATTC，與EcoR Ⅰ酶切后形成的粘端互補。正義鏈：5′-GATCC-(GN18)-(TTCAAGAGA)-(N18C)-TTTTTTG-3′；反義鏈：3′-G(CN18)-(AAGTTCTCT)-(N18G)-AAAAAACTTAA-5′；退火，將合成的DNA片段與帶有綠色熒光蛋白(GFP)的載體LV3 (H1/GFP&Puro)質粒連接，構建重組慢病毒載體LV3/PDZK1 shRNA，隨即轉入感受態(tài)的大腸桿菌；將轉化的大腸桿菌接種到含Apm抗性LB瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h，挑取陽性克隆抽提質粒，進行酶切篩選，測序進一步鑒定。測序正確的菌株采用高純度質粒中量抽提試劑盒抽提質粒。

1.2.3PDZK1 shRNA慢病毒包裝及滴度測定 測序通過的質粒與pHelper 1.0載體、pHelper 2.0載體共轉染進293T慢病毒包裝細胞，于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h后收集293T細胞上清液，離心獲得病毒濃縮液，分裝后置-70 ℃冰箱中保存。采用倍比稀釋法測定重組慢病毒滴度。取對數生長期293T細胞，以2×103個細胞/孔接種至96孔板，分8組，每組設3個復孔，每孔加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基100 μl，置37 ℃、5%CO2孵箱下培養(yǎng)24 h。準備8個無菌的EP管，每管中加入90 μl的無血清培養(yǎng)基，取待測病毒原液10 μl加入第1個管中，混勻后，取10 μl加入第2個管中，以此操作直至最后一管。選取對應細胞孔，棄掉90 μl培養(yǎng)基，加入90 μl稀釋好的病毒溶液，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。各組加入病毒原液相當于10、1、10-1、10-2、10-3、10-4μl；24 h后補足完全培養(yǎng)基至200 μl；48～72 h后，觀察綠色熒光表達情況。病毒滴度為每孔GFP陽性細胞數/病毒原液量。

1.2.4BRL-3A細胞的LV3/PDZK1 shRNA重組慢病毒感染 轉染前1 d，取(2～3)×105個細胞/孔的BRL-3A細胞接種在6孔板上，培養(yǎng)24 h后將原有培養(yǎng)基棄去，加入2 ml的細胞完全培養(yǎng)基；置于5%CO2的培養(yǎng)箱中，于37 ℃培養(yǎng)至細胞匯合達到40%～60%；細胞換液，將病毒液與終濃度5 μg/ml polybrene加入新鮮培養(yǎng)基中，經空病毒感染或未感染的BRL-3A細胞作為對照；8～12 h后觀察細胞狀態(tài)，若細胞狀態(tài)無明顯病變，繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。BRL-3A細胞選用MOI=20進行病毒轉染，病毒用量(μl)=(細胞數×MOI值/病毒原液滴度)×103；24～48 h觀察GFP的表達情況并拍照。

1.2.5LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細胞PDZK1和膽管側膜Bsep基因表達的影響 收集經慢病毒感染48 h的BRL-3A細胞，使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，采用RT-PCR法檢測PDZK1、Bsep基因的mRNA表達水平，以空病毒感染的BRL-3A細胞的同樣檢測作為對照，以β-actin基因作為內參。大鼠PDZK1、Bsep特異檢測引物見1.2.1。

1.2.6LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細胞PDZK1和膽管側膜Bsep蛋白表達的影響 采用Western blot法將經慢病毒感染48 h的BRL-3A細胞總蛋白以及膜蛋白分別提取、轉移至硝酸纖維膜，再浸于含PDZK1一抗(1 ∶500)與Bsep一抗(1 ∶500)的封閉液中，4 ℃過夜；加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1 ∶3 000)，室溫孵育0.5 h，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min；隨后與混合好的ECL溶液結合1～2 min，顯色拍照，以β-actin作為內參。

2 結果

2.1 PDZK1最佳siRNA靶點的篩選采用RT-PCR法和Western blot方法從3對siRNA中篩選出最佳RNA干擾序列(表1、圖1)，結果選定Pdzk1-rat-914對應的序列進行病毒包裝。

2.2 PDZK1 shRNA慢病毒載體的構建與鑒定重組慢病毒載體LV3/PDZK1 shRNA經限制性酶切酶BamHⅠ與EcoRⅠ酶切，酶切結果表明，被EcoR Ⅰ切開的可能是陽性克隆(圖2)。將陽性克隆進行測序鑒定證實，攜帶PDZK1 shRNA的重組慢病毒載體LV3/PDZK1 shRNA得以成功構建。

表1 siRNA序列信息

圖1 BRL-3A細胞轉染PDZK1 siRNA進行篩選

2.3 PDZK1 shRNA慢病毒重組體的包裝及其滴度測定Lipofectamine2000基因轉染試劑介導LV3/PDZK1 shRNA慢病毒質粒DNA轉染293T細胞，培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察，可見GFP強表達(圖3)。以倍比稀釋方法檢測其病毒滴度為: 1×109TU/ml。

2.4 BRL-3A細胞的LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染未經LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染的BRL-3A細胞不表達GFP(圖3C)，經LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染的BRL-3A細胞，熒光顯微鏡觀察可見明顯GFP表達(圖3D)。

2.5 LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細胞的PDZK1、Bsep基因表達的影響提取未經感染的BRL-3A細胞(blank)、空載病毒感染48 h的BRL-3A細胞(NC)、LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染48 h的BRL-3A細胞(shRNA)總RNA為模板，進行RT-PCR檢測，結果顯示shRNA組PDZK1、Bsep基因的mRNA相對表達水平為：(0.17±0.02)、(0.43±0.07)；NC組PDZK1、Bsep基因的mRNA相對表達水平為：(0.97±0.06)，(0.94±0.25)；與NC組比較，shRNA組PDZK1、Bsep基因的mRNA相對表達水平顯著抑制(P<0.01)，見圖4。由此提示，重組慢病毒LV3/PDZK1 shRNA能在mRNA水平有效沉默BRL-3A細胞的PDZK1、Bsep基因的表達。

2.6 LV3/PDZK1 shRNA慢病毒對BRL-3A細胞PDZK1及Bsep蛋白表達的影響Western blot檢測blank、NC、shRNA這3個組BRL-3A細胞的PDZK1及Bsep蛋白表達情況。結果顯示與blank組和NC組比較，shRNA組的PDZK1和Bsep蛋白表達均顯著降低(P<0.01)，見圖5。由此提示，在RNA水平沉默BRL-3A細胞PDZK1基因可有效抑制其PDZK1及Bsep蛋白表達。

圖2 PDZK1 shRNA慢病毒載體的構建示意圖

圖3 LV3/PDZK1 shRNA慢病毒感染的細胞 ×100

圖4 BRL-3A細胞中PDZK1及Bsep基因表達

A：PDZK1基因表達情況；B：Bsep基因表達情況，以actin為內參；與shRNA組比較：**P<0.01

圖5 BRL-3A細胞中PDZK1及Bsep蛋白表達

A：PDZK1蛋白表達情況；B：Bsep蛋白表達情況；與shRNA組比較：**P<0.01

3 討論

近年來，PDZK1對藥物轉運體的調控作用逐漸引起重視。PDZK1具有PDZ結構域，可以特異性識別并結合轉運體C末端大約5個氨基酸長度的特定序列模塊的肽類(PDZ結合域)。PDZK1大量分布在肝、腎、小腸，與多數轉運體的分布一致。機體病理狀態(tài)通過誘導PDZK1表達改變，繼而引起某些轉運體表達和功能異常。例如慢性腎病(CKD)大鼠的腎臟上皮細胞和腸道上皮細胞PDZK1表達受到顯著抑制，導致轉運體(Mrp4和OCTN1)定位紊亂和功能下降。因此，PDZK1已被視為轉運體相關疾病的新的治療靶點[4]。

炎癥誘導肝細胞膽管側膜ABC轉運體的表達與功能改變，是造成膽汁生成和排泌受阻的直接原因[5]。α-萘異硫氰酸酯(ANIT)能夠誘導肝臟炎性細胞浸潤并且明顯影響肝臟轉運體(Bsep、NTCP)，促進膽汁淤積形成[6]。內毒素誘導膽汁淤積大鼠的膽管側膜Bsep表達下調亦與肝組織炎癥程度緊密相關[7]。然而，炎癥影響ABC轉運體的機制尚不清楚。有報道[8]發(fā)現炎癥因子能夠抑制PDZK1蛋白表達。最新研究[9]顯示炎癥性肝損傷能夠引起PDZK1、膽管側膜Bsep和Mrp2表達均顯著下調。上述研究提示炎癥很可能通過PDZK1這一中介對膽管側膜ABC轉運體實現調控。

因此，運用RNA干擾技術，針對大鼠PDZK1基因序列，設計與篩選出PDZK1基因的3個干擾靶點。從3個干擾靶點中篩選到PDZK1基因的最佳干擾靶點。設計并合成針對最佳干擾靶點的shRNA靶序列，連入LV3載體，成功構建了LV3/PDZK1 shRNA慢病毒載體，實現了該慢病毒載體對大鼠BRL-3A肝細胞的有效感染。RT-PCR與Western blot檢測證實，LV3/PDZK1 shRNA慢病毒載體能夠介導PDZK1 shRNA有效沉默BRL-3A細胞的PDZK1表達，同時下調膽管側膜Bsep的表達，提示PDZK1 shRNA可能通過沉默BRL-3A細胞的PDZK1，使BRL-3A細胞膽管側膜Bsep表達減少。而PDZK1下調引起B(yǎng)sep表達降低的機制可能與Bsep定位紊亂和發(fā)生降解有關。文獻[10]報道，轉運體(Oap1a1)需要PDZK1協(xié)同招募驅動蛋白kinesin-1，才能正確地運輸至肝細胞膜；敲除PDZK1可導致Oap1a1堆積在細胞內并大量降解。另一項研究[11]發(fā)現，人腎上皮HEK293細胞的PDZK1過表達能夠明顯上調轉運體(MRP4)表達水平，可能與PDZK1減少MRP4降解有關。綜上所述，PDZK1可能扮演著一個在細胞內協(xié)助運輸轉運體分子至細胞頂側膜，并且使其穩(wěn)定表達的伴侶蛋白的角色。