葉長(zhǎng)江,陳 成,鄭凌霄,劉 嘯,陶香林,楊邦和,孫恩濤

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002;2.皖南醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

粉塵螨(Dermatophagoidesfarina)屬粉螨亞目(Acarida)、麥?zhǔn)瞅?Pyoglyphiae)，主要以有機(jī)殘屑為食，在自然界中分布廣泛，孳生在糧食、干果、中草藥等儲(chǔ)藏物中，會(huì)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]；近十年，過敏性疾病成為全世界關(guān)注的熱點(diǎn)公共健康問題，我國每年有近1千萬的兒童患哮喘和5千萬成人患過敏性鼻炎，而各種螨類被認(rèn)為是主要的過敏原，臨床上超過50%的過敏性疾病歸因于螨類。螨種類繁多，其中粉塵螨在人居環(huán)境中廣泛存在[4]，因此粉塵螨的防治具有重要的意義。

種群遺傳結(jié)構(gòu)是種群遺傳的主要特征之一，可通過種群遺傳多樣性、遺傳距離和遺傳分化等參數(shù)來衡量遺傳多樣性在種群間和種群內(nèi)的時(shí)空分布。研究表明，擴(kuò)散能力(主動(dòng)或被動(dòng))、地理隔離、寄主及其他外界生態(tài)因子均可影響并形成螨蟲獨(dú)特的種群遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化[5-6]。分子標(biāo)記是研究種內(nèi)不同種群間遺傳多態(tài)性、遺傳分化等遺傳結(jié)構(gòu)特征十分有用的工具，普遍用于研究種群遺傳結(jié)構(gòu)的分子標(biāo)記為微衛(wèi)星、AFLP和線粒體基因等。線粒體DNA具有突變率較高、單親遺傳、一般沒有重組、對(duì)種群瓶頸以及種群再分比較敏感的特點(diǎn)[7-8]，楊小強(qiáng)[9]等以線粒體cox1基因片段為分子標(biāo)記，對(duì)馬六甲肉食螨的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)的成因進(jìn)行了探討，認(rèn)為其系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)不僅長(zhǎng)期受到自然歷史地理環(huán)境的影響，近期人為干擾如糧食的生產(chǎn)及貿(mào)易也促進(jìn)了其在不同種群間的交流，從而導(dǎo)致原有的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。研究利用系統(tǒng)地理學(xué)的分析方法，以線粒體基因COI基因作為分子標(biāo)記，分析了采自我國3個(gè)省4個(gè)地理種群粉塵螨的遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)，以期為粉塵螨制定有效的可持續(xù)控制策略提供種群分子遺傳學(xué)方面的基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 粉塵螨樣本采集

粉塵螨樣本來自河北省石家莊市，山東省濟(jì)南市，安徽省的淮南市和蕪湖市4個(gè)地區(qū)，在當(dāng)?shù)氐拿娣奂庸S將可能含有粉塵螨的面粉和地塵用自封袋裝好，帶回實(shí)驗(yàn)室，在光學(xué)顯微鏡下從粉塵螨樣本中挑取單只雌螨。具體樣本采集信息見表1。

表1 河北、山東和安徽三省粉螨采集情況

1.2 基因組DNA的提取

實(shí)驗(yàn)前一天收集粉塵螨，干饑餓處理。實(shí)驗(yàn)前，離心3 000～5 000 r，3 min，使粉塵螨落在管底。參考Jia[10]等提取DNA的方法，提取單個(gè)粉塵螨DNA。

1.3 PCR擴(kuò)增及反應(yīng)體系

上游引物：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3',下游引物：5'-ATTTTTTGGTCACCCTGAAGTTTA-3'(購自上海生工生物工程有限公司)。12.5 μL反應(yīng)體系中含上下游引物各0.5 μL，ddH2O 4.75 μL，Mix 6.25 μL，模板0.5 μL。線粒體COI基因擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s,48 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，34次循環(huán)，72 ℃延伸6 min，設(shè)陰性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，于紫外燈下觀察并記錄結(jié)果。

1.4 擴(kuò)增產(chǎn)物純化及序列測(cè)定

用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購自上海天根生物公司)，對(duì)目的片段進(jìn)行回收，將目的片段連接至pUcm-T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5-α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆，送至上海生工生物工程有限公司雙向測(cè)序。

1.5 序列分析

用Chromas 2軟件進(jìn)行校對(duì)測(cè)序序列，并用DNAstar軟件包[11]進(jìn)行雙向?qū)?zhǔn)和拼接，最后在ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，必要時(shí)需人工修正，生成序列矩陣。用DnaSP 5軟件統(tǒng)計(jì)單倍型，計(jì)算各種群的單倍型多樣性(h)、核苷酸多態(tài)性(P)；利用MEGA 5軟件包分析序列特征，計(jì)算遺傳變異和遺傳距離[12]。利用Arlequin3.5.2.2[13]和DnaSP 5軟件進(jìn)行中性檢驗(yàn)，計(jì)算Tajima's D值、Fu和Li's D值、Fu和Li's F值，以檢驗(yàn)是否符合中性變異，評(píng)估粉塵螨種群歷史。用分子變異分析法(Analysis of molecular variance，AMOVA)分析種群間遺傳分化指數(shù)Fst，將4個(gè)地理種群歸為一大組，排列置換數(shù)為1 000。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。

2 結(jié)果

2.1 單個(gè)粉塵螨基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增

粉塵螨COI基因的PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)約709 bp，所有序列條帶均清晰可見，經(jīng)克隆測(cè)序，共獲得37個(gè)有效序列。

2.2 COI基因序列特征

研究擴(kuò)增的片段為COI基因，經(jīng)對(duì)比校正，獲得長(zhǎng)度為709 bp的序列，GC含量約為35.699 3%。多序列進(jìn)行對(duì)比，顯示共有709個(gè)信息位點(diǎn)，其中多態(tài)位點(diǎn)41個(gè)，占5.92%，多態(tài)位點(diǎn)中簡(jiǎn)約位點(diǎn)有31個(gè)(75.6%)，其余為堿基突變。利用DnaSP5軟件統(tǒng)計(jì)各種群?jiǎn)伪缎?，樣本中共檢出16個(gè)單倍型(見表2)，其中僅H-1為河北石家莊和安徽淮南共享單倍型，其他均為獨(dú)享單倍型。

2.3 種群遺傳多樣性分析

4個(gè)粉塵螨種群的h值較高，范圍在0.423～0.905，平均值為0.847；核苷酸P值較低，范圍為0.000 65～0.012 76，平均值為0.021 08。4個(gè)種群均顯示出較豐富的遺傳多樣性。粉螨種群遺傳多樣性參數(shù)如表2所示。綜合分析顯示，安徽蕪湖遺傳多樣性最高，安徽淮南遺傳多樣性最低。

2.4 種群遺傳分化

序列的差異程度反映了種群親緣性的遠(yuǎn)近，用MEGA 5.05軟件中的Tamura-Nei距離模型計(jì)算種群內(nèi)及種群間的遺傳距離。粉螨各種群的遺傳距離(左下角)和粉螨種群間Fst值(右上角)如表3所示。由表3可知，種群間的遺傳距離在0.002～0.043。4個(gè)種群兩兩比較,Fst值在0.077 38～0.974 21，表明遺傳分化明顯，遺傳距離大的種群分化明顯，種群間Fst分析與遺傳距離分析結(jié)果一致。

表2 4個(gè)粉螨種群遺傳多樣性參數(shù)

表3 粉螨各種群遺傳距離(左下角)和粉螨種群間Fst值(右上角)

注：左下角的數(shù)字表示的是粉螨種群間Fst值，右上角的數(shù)字表示的是種群之間的平均遺傳距離。

基于COI基因粉螨種群的中性檢驗(yàn)結(jié)果如表4所示。由表4可知，在物種水平上，Tajima's D值，F(xiàn)u和Li's D值，F(xiàn)u和Li's F值分別為1.731 81(0.050.10)，0.609 32(P>0.10)，表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，認(rèn)為目標(biāo)序列在進(jìn)化上遵循中性模型。值得注意的是，安徽蕪湖種群的Tajima's D值，F(xiàn)u和Li's D值，F(xiàn)u和Li's F值分別為-1.627 44(P<0.05)，-1.707 48(P<0.05)，-1.866 77(P<0.05)，且均顯著，暗示該種群可能經(jīng)歷了歷史的擴(kuò)張。

表4 基于COI基因粉螨種群的中性檢驗(yàn)結(jié)果

分子變異分析結(jié)果如表5所示。由表5可知，AMOVA分析的結(jié)果表明有87.34%(P<0.001)的遺傳變異存在于種群間，僅有12.66%的遺傳變異位于種群內(nèi)。

表5 分子變異分析結(jié)果

Fst=0.873 38,P=0.000 00。

2.5 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖

用NetWork 5.0.1.1構(gòu)建16個(gè)單倍型的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化關(guān)系樹，計(jì)算方法為Median Joining。共分為A、B兩大分支，A分支中共享單倍型H-1位于分支的中心，A分支含有分屬于4個(gè)地理種群的8種單倍型共27個(gè)個(gè)體；B分支均為獨(dú)有單倍型，含有屬于4個(gè)地理種群的8種單倍型共10個(gè)個(gè)體。結(jié)果顯示，各單倍型已經(jīng)發(fā)生明顯的遺傳分化，但單倍型的聚類關(guān)系與單倍型的地理分布沒有顯示出明顯的相關(guān)性。

16種單倍型(H-1～H-16)網(wǎng)狀關(guān)系圖如圖1所示。圖1中圓形的大小代表單倍型的頻率，圓圈大小與單倍型頻率相對(duì)應(yīng)，空白圓圈代表缺失單倍型。

圖1 16種單倍型(H-1～H-16)網(wǎng)狀關(guān)系圖

3 討論

實(shí)驗(yàn)利用COI基因?qū)θA東和華中地區(qū)三省四地的粉塵螨不同地理種群進(jìn)行了遺傳多樣性分析，共獲得37個(gè)粉塵螨線粒體的COI基因部分序列，發(fā)現(xiàn)16個(gè)單倍型，占43.24%，表明粉塵螨種群遺傳多態(tài)性較豐富。4個(gè)地理種群的單倍型h值均較高，P值均較低，顯示粉塵螨種群可能是由一個(gè)較小的有效種群經(jīng)歷瓶頸效應(yīng)[15]和建群者效應(yīng)[16]后而得到快速增長(zhǎng)。這和螨蟲的生活史有很大的關(guān)系,其在不同的季節(jié)數(shù)量差異很大：春季開始繁殖，夏季數(shù)量最多,進(jìn)入冬季由于寒冷、缺少食物等原因致大批個(gè)體死亡，至第二年春季，由少量殘存的個(gè)體繁衍導(dǎo)致后代基因頻率由殘存?zhèn)€體基因頻率決定，形成了冬季數(shù)量減少的瓶頸樣[5]。其中安徽淮南的P值最低，表明其地理種群是這種遺傳效應(yīng)表現(xiàn)較為明顯的種群之一。

4個(gè)地理種群中蕪湖地區(qū)的粉塵螨遺傳多樣性最高，可能和當(dāng)?shù)氐臍夂蛴嘘P(guān)。長(zhǎng)江以南地區(qū)全年的平均氣溫和濕度均較高，更適宜于粉塵螨的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖，即有利于種群的增長(zhǎng)，增加了種群的遺傳多樣性的豐富度。這和中性檢測(cè)的結(jié)果一致，Tajima's D統(tǒng)計(jì)值為顯著的負(fù)值(P<0.05)，F(xiàn)u's FS統(tǒng)計(jì)值也為極顯著的負(fù)值(P<0.05)，D檢驗(yàn)如果得到負(fù)的顯著結(jié)果,既有可能是負(fù)選擇造成的,也可能是搭載效應(yīng)的信號(hào)[17]，統(tǒng)計(jì)都表明該種群發(fā)生過快速擴(kuò)散，顯示了該種群具有較強(qiáng)的進(jìn)化潛力和高水平的適應(yīng)能力[18-19]。

Wright建議[20]，在實(shí)際研究過程中，如果Fst為0～0.05，群體間遺傳分化很小，可以不考慮；Fst為0.05～0.15，存在中等程度的遺傳分化；Fst為0.15～0.25，遺傳分化較大；Fst為0.25以上，顯示有很大的遺傳分化。從研究結(jié)果來看，蕪湖和濟(jì)南的種群之間遺傳分化呈中等程度，種群之間遺傳分化較大。濟(jì)南與石家莊、濟(jì)南與淮南、蕪湖與石家莊、蕪湖與淮南之間有很大的遺傳分化。AMOVA分析結(jié)果表明，高達(dá)87.34 % (P<0.001)的變異分布于種群間，而種群內(nèi)僅占12.66 %，表明種群間存在顯著遺傳分化，因此，不同地區(qū)的螨類防控有必要采用不同的防治方法，以達(dá)到最優(yōu)的效果。

粉塵螨體小，無翅，遷移能力有限，自身只能進(jìn)行短距離的傳播，自然條件下，儲(chǔ)藏物螨類要發(fā)生長(zhǎng)距離的傳播只可能借助外力的幫助。儲(chǔ)藏物螨類分布如果只受自然環(huán)境的作用，理論上不同地理種群之間會(huì)顯示出明顯的系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)，種群之間的遺傳距離與地理距離應(yīng)該會(huì)顯示出一定的相關(guān)性；而研究利用單倍型構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化關(guān)系樹則沒有明顯的地理分布相關(guān)性，表明粉塵螨的分布受到很強(qiáng)的人為干擾。由于糧食作物的貿(mào)易交流、交通等因素導(dǎo)致粉塵螨在不同種群之間交流[21-22]，因此在糧食及藥材交易前，應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)尿惙乐?，以減少螨類的擴(kuò)散和交流。