高 亮，蔡為榮，張孟雪，岳丹偉

(安徽工程大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

荷葉為睡蓮科植物蓮(Nymphaeaceae Genus)的干燥葉，味苦性平，歸肝、脾、胃經(jīng)，具有升發(fā)清陽、涼血止血等功效 ,現(xiàn)代研究表明荷葉具有調(diào)節(jié)血脂、止咳化痰、降低血壓等作用[1]?！侗静菥V目》記載：“荷葉服之，令人瘦劣。單服可以消陽水浮之氣”。中華人民共和國衛(wèi)生部在1991年第45號文件將荷葉列入第二批“既是食品又是藥品”名單[2]。研究表明：荷葉富含原花青素、黃酮、槲皮素、生物堿等，具有抗氧化、抗腫瘤等多種生物活性。原花青素(Poranthocyanidins，OPC)是具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)的黃烷醇及其聚合體，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成[3-4]。對原花青素最早的研究始于20世紀(jì)50年代，法國科學(xué)家Masquelier J首次從松樹皮中提取出該類物質(zhì)[5]。原花青素是由兒茶素和表兒茶素通過不同聚合度聚合而成的一類聚合物，上下單元間以4～8或4～6位C-C鍵相連，從而形成具有不同聚合度的聚合物。原花青素廣泛存在于自然界的植物中，在某些植物的皮和籽中含量較高。高速逆流色譜(HSCCC)分離技術(shù)是一種新興的色譜分離技術(shù)，相對于一般分離技術(shù)而言，其特點(diǎn)在于流動相和固定相都為液體，沒有不可逆吸附，具有分離效率高，對樣品無損耗，制備量大等優(yōu)點(diǎn)。目前對于高速逆流色譜分離原花青素的研究較少，N Savitri Kumar[6]等利用高速逆流色譜分離茶葉中的原花青素。近些年來的研究證明，原花青素具有很強(qiáng)的抗氧化活性，其抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍，此外還可以降血壓、提高血管活性，對缺血-再灌注損傷、抗動脈粥狀硬化以及抗血小板凝固有很高的醫(yī)療價值；在抗腫瘤方面，對多種癌細(xì)胞，例如乳腺、前列腺癌細(xì)胞等都有一定程度的抑制作用。關(guān)于荷葉原花青素，采用高速逆流色譜分離技術(shù)相對于之前的相關(guān)研究具有一定的創(chuàng)新，為分離荷葉原花青素提供了一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

荷葉采摘自校內(nèi)池塘，洗凈，放入40 ℃烘箱(常壓下)內(nèi)烘干，過80目篩，封口后保存于干燥陰涼處；兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS編號7295-85-4)，表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品(CAS編號490-46-0)，表兒茶素沒食子酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(CAS編號490-46-0)(含量均>98%，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司)；原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品(含量>98%，CAS編號29106-49-8，南京市淵科技有限公司)；乙醇、乙酸乙酯、乙酸、石油醚(均為分析純)，乙腈、甲醇(均為色譜純)(國藥集團(tuán)有限公司)；正己烷(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；AB-8大孔樹脂(天津南開化工廠)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

表1 主要儀器與設(shè)備

1.3 實驗方法

(1)荷葉原花青素樣品的制備。取干燥后的干荷葉粉以料液比1∶20加入質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，在40 ℃條件下水浴加熱1 h，抽濾后浸提兩次，洗滌濾渣。將兩次提取液合并，減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，再用AB-8大孔樹脂洗脫除去糖類、蛋白質(zhì)類雜質(zhì)。方法為將濃縮液上樣放入經(jīng)過預(yù)處理后的樹脂柱中進(jìn)行純化，先用蒸餾水洗去雜質(zhì)至流出液無色，用45%乙醇溶液洗脫并收集洗脫液，再將洗脫液減壓濃縮除去有機(jī)溶劑，之后加入飽和的NaCl溶液。經(jīng)過濾后，先用3倍體積的乙酸乙酯萃取2次，再用2倍體積的石油醚沉淀兩次，最終得到荷葉原花青素樣品。將其放入冷凍干燥機(jī)中，凍干成粉備用。顯色劑：10%香草醛鹽酸溶液。

(2)HSCCC法分離荷葉原花青素溶劑體系的選擇。分離溶劑體系的選擇對于高速逆流分離效果的好壞有著重大的影響。一個好的溶劑體系應(yīng)該具備以下3個條件：具備較高的固定相保留率；分配系數(shù)K范圍應(yīng)該在0.5

(3)HSCCC分離純化原花青素。配好所選的溶劑體系倒入分液漏斗中，充分搖勻，并記錄分層時間，分配半小時達(dá)到平衡，倒出上下相溶劑，超聲脫氣30 min備用。取上述濃縮后的浸膏0.5 g，取等量上、下相將其溶解，過0.45 μm過濾器后作為樣液。先打開紫外檢測器開始預(yù)熱，以流速40 mL/min泵入固定相，待固定相充滿整個管路后，色譜檢測器出口端流出固定體積相約為50 mL后停泵。將主機(jī)調(diào)至正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速設(shè)置為900 r/min，同時以2 mL/min的流速泵入流動相，至檢測器出口端流出液體且紫外信號穩(wěn)定，此時系統(tǒng)達(dá)到平衡，進(jìn)樣10 mL并啟動色譜工作站記錄譜圖，同時將檢測波長設(shè)為280 nm，分峰段收集出口段的組分用于之后的HPLC檢測。

(4)高效液相色譜鑒定。色譜條件：流動相B：乙腈，流動相A：0.4%乙酸水溶液；色譜柱：C18，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，將上述組分配制成甲醇溶液，用于HPLC檢測，洗脫程序。HPLC洗脫條件如表2所示。

表2 HPLC洗脫條件

(5)原花青素含量的測定。研究采用香草醛鹽酸法測定原花青素的含量，按條件配制A液B液，其中A液為1%的香草醛甲醇溶液，B液為8%的鹽酸甲醇溶液。將A液B液按照1∶1的比例混合成顯色劑。配制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.2 mg/mL，分別取標(biāo)準(zhǔn)液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL定容至10 mL，分別取1 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液并加入5 mL顯色劑，在避光條件下30 ℃水浴加熱30 min，隨后測定吸光度并繪制兒茶素標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣液1 mL加入顯色劑測定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其原花青素的質(zhì)量濃度，并計算出原花青素含量。計算公式如下：

M=C×V,

式中，C為原花青素質(zhì)量濃度；V為樣品體積；M為原花青素質(zhì)量。

(6)荷葉原花青素組分的抗氧化活性研究。對高速逆流色譜分離出的組分進(jìn)行抗氧化活性研究即對所得組分進(jìn)行清除DPPH、ABTS+和羥基自由基的能力進(jìn)行實驗研究。

①DPPH自由基清除率的測定：參考孫志武[11]等的方法略作改動，分別吸取0.4 mL不同質(zhì)量濃度樣品溶液于試管中，加入2 mL 0.1 mmoL/L的DPPH溶液，混合均勻，避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測其吸光度記為A2；吸取0.4 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與2 mL無水乙醇混合均勻，避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測其吸光度記為A1；吸取0.4 mL無水乙醇，加入2 mL 0.1 mmoL/L的DPPH溶液，混合均勻，避光反應(yīng)30 min，在波長517 nm處測其吸光度記為A0。同時測定維生素C對DPPH自由基的清除率作為對比。按照下列公式計算清除率：

②ABTS+自由基清除率的測定：參照蔣孟君[12]等的方法，將0.5 mL不同質(zhì)量濃度原花青素溶液與4 mL ABTS+工作液混勻，30 ℃水浴加熱6 min，在波長734 nm處測其吸光度A2；將0.5 mL超純水與4 mL ABTS+工作液混勻，30 ℃水浴加熱6 min，在波長734 nm處測其吸光度A0；將0.5 mL不同質(zhì)量濃度原花青素溶液與4 mL無水乙醇混勻，30 ℃水浴加熱6 min，在波長734 nm處測其吸光度A1。以VC溶液作為陽性對照，按照下列公式計算清除率：

③羥基自由基清除率測定：參考楊芬[13]等的方法略作改動，采用水楊酸法測定原花青素對羥基自由基(·OH)的清除作用。吸取不同質(zhì)量濃度樣品1 mL,分別加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4和1.5 mL水楊酸乙醇溶液，然后加入0.1 mL 0.03% H2O2，置于37 ℃中水浴加熱0.5 h后3 000 r/min離心分離10 min，于510 nm處測吸光度記為A1,VC作為陽性對照，測得吸光度記為A0，再取不同質(zhì)量濃度樣品1 mL，分別加入2 mL 1.8 mmol/L FeSO4和1.5 mL水楊酸乙醇溶液，然后加入0.1 mL H2O，于510 nm處測得吸光度記為A2羥基自由基(·OH)。清除率計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 HSCCC分離荷葉原花青素

高速逆流色譜技術(shù)分離經(jīng)大孔樹脂純化后的荷葉原花青素HSCCC色譜圖如圖1所示。其中溶劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶水=1∶80∶80。

圖1 高速逆流色譜技術(shù)分離經(jīng)大孔樹脂純化后的荷葉原花青素HSCCC色譜圖

2.2 荷葉原花青素色譜分析

根據(jù)HPLC圖可知，共檢測出四種原花青素物質(zhì)，其中包括兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸和原花青素B2。四種原花青素標(biāo)準(zhǔn)品圖如圖2所示。由圖2可知，從左至右依次為兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、原花青素B2。原花青素樣品的HPLC圖如圖3所示。經(jīng)HSCCC分離后的組分G1的HPLC圖如圖4所示。由圖4可知，組分G1中含有表兒茶素沒食子酸酯和原花青素B2。經(jīng)HSCCC分離后的組分G2的HPLC圖如圖5所示。由圖5可知，G2為表兒茶素。經(jīng)過HSCCC分離后的組分G3的HPLC圖如圖6所示。由圖6可知，G3為兒茶素。

圖2 四種原花青素標(biāo)準(zhǔn)品圖

圖3 原花青素樣品的HPLC圖

圖4 經(jīng)HSCCC分離后的組分G1的HPLC圖

圖5 經(jīng)HSCCC分離后的組分G2的HPLC圖

圖6 經(jīng)過HSCCC分離后的組分G3的HPLC圖

2.3 HSCCC分離純化原花青素條件的建立

溶劑系統(tǒng)的選擇對分離效果至關(guān)重要，實驗設(shè)計不同的溶劑體系對于荷葉原花青素分離效果的影響。以上下相溶劑系統(tǒng)的分層時間以及物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)作為衡量標(biāo)準(zhǔn)，得到溶劑體系正己烷∶乙酸乙酯∶水=1∶80∶80，按比例將溶劑配置好，再將配置好的溶劑放入分液漏斗中，搖勻上下相，記錄分層時間。以上相作為固定相，下相作為流動相，以40 mL/min泵入上相，再以2 mL/min泵入下相，水浴溫度設(shè)為25 ℃，轉(zhuǎn)速為900 r/min，檢測波長設(shè)為280 nm，收集峰組分，電腦記錄譜圖。固定相保留率為62%。其中保留率計算公式為：

式中，V總為柱總體積；V流為固定相被流動相排出的體積。

分配系數(shù)K的測定。使用分液漏斗配置好溶劑系統(tǒng)，充分搖勻，靜置平衡，記錄溶劑系統(tǒng)分層時間T。取適量荷葉原花青素凍干樣用下相溶解，取3 mL下相加入相同體積上相充分混合，分離上下相用于高效液相色譜檢測，分配系數(shù)K計算公式為：

式中，A1為荷葉原花青素目標(biāo)組分在上相中的峰面積；A2為荷葉原花青素目標(biāo)組分在下相中的峰面積。

HSCCC溶劑體系表如表3所示。從表3中可以看出,溶劑體系2和溶劑體系3溶劑系統(tǒng)分層時間過長，而溶劑體系4則分配系數(shù)過大且溶劑系統(tǒng)分層時間過長，據(jù)此選擇溶劑體系1作為高速逆流色譜分離的溶劑體系。

表3 HSCCC溶劑體系表

2.4 荷葉原花青素抗氧化活性研究

(1)DPPH自由基清除實驗。荷葉原花青素經(jīng)過高速逆流色譜分離出的三種組分對DPPH自由基的清除率如圖7所示。HSCCC分離出的三種組分對DPPH自由基的清除率，隨著三種物質(zhì)質(zhì)量濃度增加，對DPPH自由基的清除率也隨之增加。在樣品質(zhì)量濃度為0.03 mg/L時，DPPH自由基的清除率為G2>G1>G3>VC，當(dāng)VC質(zhì)量濃度在0.15～0.27 mg/L范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度增加，VC對DPPH的清除率顯著提升。當(dāng)三種組分樣品質(zhì)量濃度達(dá)到0.27 mg/L時，隨著質(zhì)量濃度的增加，樣品對DPPH自由基的清除率變化趨于穩(wěn)定。當(dāng)VC質(zhì)量濃度達(dá)到0.39 mg/L時，對DPPH自由基的清除率為88.21%。由圖7可知三種組分與VC的自由基半數(shù)清除數(shù)有顯著差異， 且G2的DPPH自由基清除率最高。

圖7 荷葉原花青素經(jīng)過高速逆流色譜分離出的三種組分對DPPH自由基的清除率

(2)ABTS+自由基清除實驗。荷葉原花青素經(jīng)過高速逆流色譜分離出的三種組分對ABTS+自由基的清除率的變化如圖8所示。由圖8可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，ABTS+自由基的清除率也逐步增加。從半數(shù)自由基清除數(shù)上看，G3的自由基清除效果最好。自由基清除率大小為G3>G2>G1>VC，在質(zhì)量濃度為0.1～0.2 mg/mL時，G1與VC的自由基清除率差別較小。在質(zhì)量濃度為0～0.5 mg/mL時，G3的自由基清除率隨質(zhì)量濃度的增加有顯著提升。當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.5 mg/mL時，自由基清除率趨于穩(wěn)定。G3的IC50值顯著小于其他組分，具有良好的ABTS+自由基清除能力。

(3)羥基自由基清除實驗。荷葉原花青素經(jīng)過高速逆流色譜分離出的三種組分對羥基自由基的清除率大小的變化如圖9所示。由圖9可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，羥基自由基的清除率也在逐步增加，從半數(shù)清除自由基上看，G3的自由基清除效果最好，清除率大小為G3>G2>G1>VC，總體而言，分離出的原花青素各個組分的羥基自由基清除率都要優(yōu)于VC。

圖8 荷葉原花青素經(jīng)過高速逆流色譜分離出的三種組分對ABTS+自由基的清除率的變化 圖9 荷葉原花青素經(jīng)過高速逆流色譜分離出的三種組分對羥基自由基的清除率大小的變化

3 結(jié)論

實驗采用了高速逆流色譜分離技術(shù)，對荷葉原花青素進(jìn)行分離，通過實驗確定采用溶劑系統(tǒng)為正己烷∶乙酸乙酯∶水=1∶80∶80，收集分離出的三種組分經(jīng)HPLC鑒定表明G1為表兒茶素沒食子酸酯和原花青素B2，G2為表兒茶素，G3為兒茶素。將HSCCC分離出的三種組分進(jìn)行抗氧化活性研究，實驗結(jié)果表明DPPH自由基清除效能G2>G1>G3>VC，ABTS+自由基清除效能G3>G2>G1>VC，羥基自由基清除率大小為G3>G2>G1>VC。研究通過高速色譜法有效地將荷葉原花青素中的目標(biāo)組分分離出來，并進(jìn)行相應(yīng)抗氧化活性研究，為荷葉資源應(yīng)用開發(fā)提供了一定的參考。較其他研究而言，實驗采用的高速逆流色譜有著快捷高效等特點(diǎn)，后期還需對組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定及分離純化工藝優(yōu)化，以便為荷葉資源的開發(fā)利用提供更多的參考。