趙明玉,王騰騰,薛 鵬,王 磊,梁榮財,

(1.煙臺大學新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心,長效和靶向制劑國家重點實驗室,山東 煙臺 264005;2.山東綠葉制藥有限公司,山東 煙臺 264003)

微球是藥物與載體材料聚合而成的微粒分散體,緩釋微球遞送系統(tǒng)不僅能增加藥物在生物體內(nèi)的半衰期、提高生物利用度,而且還能減少患者的給藥次數(shù),提高患者的依從性[1]．近年來,使用生物可降解材料作為緩釋微球載體的數(shù)量越來越多[2-3],其中,聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)應(yīng)用最為廣泛[4]．本研究使用的PLGA 55/45是由課題組人員根據(jù)丙交酯(LA)和乙交酯(GA)的開環(huán)聚合反應(yīng)合成的[5]．

制備緩釋微球常用的方法包括乳化溶劑揮發(fā)法、噴霧干燥法以及相分離法[6]．本研究中的模型藥物醋酸奧曲肽是一種多肽,不僅水溶性較好,而且容易加熱失活,所以本研究選用相分離法制備醋酸奧曲肽微球．THOMASIN C等學者對PLA/PLGA相分離的文獻進行了總結(jié)[7-11],文獻多集中于聚合物和硅油性質(zhì)對相分離階段凝聚液滴形成的影響[12-14]．

本研究的創(chuàng)新點在于固定相分離階段的條件,只改變固化液組成,對比不同固化液組成對相分離微球體外性質(zhì)的影響．采用一系列表征方法對微球體外性質(zhì)進行了研究,如掃描電子顯微鏡(SEM)觀察微球表面和內(nèi)部形貌,激光粒度儀測定微球粒徑,氣相色譜法(GC)測定微球內(nèi)溶劑殘留,高效液相色譜法(HPLC)測定微球載藥量和體外釋放．

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1000 CST硅油(陶氏(張家港)投資有限公司);醋酸奧曲肽(上海蘇豪逸明制藥公司);二氯甲烷(中國化工試劑公司)和甲醇(中國化工試劑公司);正庚烷(國藥集團化學試劑有限公司);油酸乙酯(江西益普生藥業(yè)有限公司);PLGA 55/45(實驗室自制);乙酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司);N, N-二甲基甲酰胺(國藥集團化學試劑有限公司)．

EM-30型掃描電子顯微鏡(韓國COXEM公司);3000型激光粒度儀(英國Mastersizer公司);1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);7890B型氣相色譜儀(美國Agilent公司)．

1.2 微球的制備

稱量PLGA 55/45 2 g溶于20 mL二氯甲烷作為有機相,醋酸奧曲肽0.152 g溶于2 mL甲醇作為水相．磁力攪拌下,將水相緩慢注入到有機相中,300 r·min-1攪拌5 min即得均一混合溶液．然后將硅油倒入混合溶液中,調(diào)大轉(zhuǎn)速至700 r·min-1并攪拌10 min,將相分離的混合物迅速轉(zhuǎn)移到1 000 mL由不同成分組成的6種固化液(分別編號為Ⅰ—Ⅵ)中,見表1．待微球固化后,經(jīng)1 000目篩過濾,收集微球．用正庚烷洗去微球表面的硅油,加入20 mL 2%甘露醇水溶液凍干3 d即得．6種固化液形成6批微球(分別編號為A—F)．

表1 固化液的組成

1.3 掃描電子顯微鏡(SEM)觀察形貌

取適量微球置于培養(yǎng)皿中,加去離子水洗滌微球表面的甘露醇,用濾紙過濾微球并晾干．晾干后在培養(yǎng)皿中加入液氮沒過微球,在液氮完全揮發(fā)之前,用刀片迅速切割微球．將雙面導電膠帶粘附于鋁板上,取適量干燥的微球均勻涂布在導電膠帶上,噴金后進行掃描電子顯微鏡觀察．

1.4 粒徑的測定

采用激光粒度儀測定微粒的粒徑．為使微球分散更加均勻,使用0.1%吐溫20溶液作為分散介質(zhì)．

1.5 載藥量的測定

稱取醋酸奧曲肽微球約25 mg,加入冰醋酸2 mL,超聲處理10 min,使PLGA充分溶解,1.3×104r·min-1離心10 min,取上清液作為樣品溶液,采用HPLC法測定醋酸奧曲肽的藥物濃度,實際載藥量計算如下:

實際載藥量=(微球中實際藥物含量/微球總質(zhì)量)×100%.

1.6 殘留溶劑的測定

稱取醋酸奧曲肽微球約20 mg,加入0.05% N, N-二甲基甲酰胺-乙酸乙酯溶液1 mL,靜置1 h,使PLGA充分溶解后,采用氣相色譜法(GC)直接進樣測定醋酸奧曲肽微球中的有機溶劑殘留．

1.7 體外加速釋放測定

由于緩釋微球中藥物釋放的時間超過幾個星期甚至幾個月,所以37 ℃體外釋放試驗的質(zhì)量控制條件變得不適用．本研究采用加速釋放法,即溫度較高(45 ℃)的5%甲醇溶液作為釋放介質(zhì)．稱取醋酸奧曲肽微球約30 mg置于樣品管中,加入5%甲醇溶液5 mL,樣品管置于45 ℃水域恒溫搖床中,50 r·min-1振搖,分別在1 h, 4 h, 1 d, 3 d, 5 d, 7 d, 8 d, 9 d, 10 d, 12 d, 14 d取出樣品管, 3.6×103r·min-1離心10 min,取出4 mL上清液加入到液相小瓶中,再往樣品管中加入新鮮釋放介質(zhì)4 mL,采用HPLC法測定上清液中的藥物含量．

2 結(jié)果和討論

2.1 表面及內(nèi)部形貌

掃描電子顯微鏡觀察微球表面形貌及內(nèi)部形貌分別見圖1、圖2．

由圖1可見，所有處方的微球均為圓形且表面不光滑．由圖2可見，微球內(nèi)部空隙分布不均勻,尤其是可以觀察到各處方的微球邊緣都有不同厚度的殼層,而且隨著乙醇含量的增加,內(nèi)部空隙明顯增多,這可能與乙醇能增加二氯甲烷萃取速度有關(guān)．另外,當乙醇含量相同時,油酸乙酯體系形成的微球內(nèi)部空隙少于正庚烷體系形成的微球內(nèi)部空隙．

2.2 粒徑

相之間的相互作用和粘度會對粒徑產(chǎn)生影響[3]．固定相分離條件,考察不同固化液對微球粒徑的影響,結(jié)果見表2．

表2 粒徑與載藥量

圖1 掃描電子顯微鏡觀察微球表面形貌

圖2 掃描電子顯微鏡觀察微球內(nèi)部形貌

結(jié)果表明,不同固化液條件下制備的微球粒徑D(0.5)在35～55 μm．一方面,隨著乙醇含量的增加,2種體系形成微球粒徑均增加;另一方面,乙醇含量相同的條件下,正庚烷體系形成的微球粒徑小于油酸乙酯體系形成的微球粒徑．推測其原因為乙醇的加入會促進軟球的融合速度,從而導致粒徑變大．

2.3 載藥量

通過HPLC法測定醋酸奧曲肽微球的載藥量(表2),發(fā)現(xiàn)2個不同的體系均隨著乙醇含量的增加,微球的載藥量降低;油酸乙酯體系中形成的微球載藥量高于正庚烷體系形成的微球載藥量．分析主要原因為醋酸奧曲肽能溶解在乙醇中,所以當有乙醇存在時,能使吸附于微球表面的醋酸奧曲肽部分溶解,導致載藥量降低;油酸乙酯的粘度高于正庚烷,影響了乙醇的洗滌效果．

2.4 溶劑殘留

選取甲醇、二氯甲烷、乙醇和正庚烷為考察因素,測定各因素在微球中的殘留量,結(jié)果見表3．

表3緩釋微球的殘留溶劑量

Tab.3 Residual solvent content of sustained-release micro-spheres %

甲醇在微球形成過程中能很好地擴散,所以均沒有殘留;隨著乙醇比例的增加,二氯甲烷的含量明顯降低,表明乙醇對二氯甲烷的萃取來說具有促進作用;微球中乙醇的殘留可能與體系的粘度有關(guān),粘度增大不利于乙醇的擴散;正庚烷的殘留主要是在微球固化時滲入到微球內(nèi)部造成,且乙醇對正庚烷的萃取作用不大．

2.5 體外加速釋放

一般來說,PLGA微球中藥物的釋放大體可分為三相:“突釋”,平臺期以及快速釋放.由圖3可見,與正庚烷體系相比,油酸乙酯體系形成的微球前期釋放較快．這是由于油酸乙酯粘度大導致二氯甲烷遷移慢,微球固化偏慢造成的．此外,乙醇的加入可以明顯降低藥物的突釋．

3 結(jié) 論

本研究對比了油酸乙酯和正庚烷2種體系的固化液對相分離微球體外性質(zhì)的影響,結(jié)論如下:

(1)2種體系的固化液均能形成形狀良好的微球,微球表面不光滑且內(nèi)部空隙分布不均勻．

(2)微球粒徑在35～55 μm之間,是由多種因素的相互作用導致的,固化液組成不占主導作用．

(3)固化液中的乙醇能溶解部分醋酸奧曲肽,當乙醇含量增加時,微球載藥量降低．

圖3 體外加速釋放曲線(n=3)

(4)甲醇作為醋酸奧曲肽的溶劑,在微球中沒有殘留;乙醇作為二氯甲烷的良溶劑,能有效地降低二氯甲烷的含量,但乙醇的殘留會增加;正庚烷在微球固化瞬間深入到微球內(nèi)部,很難除去．

(5)2種體系形成的微球體外釋放均遵循“三相釋放”理論．油酸乙酯體系形成的微球較正庚烷體系形成的微球前期釋放較快且乙醇能有效降低藥物的突釋．