李婷婷， 張?zhí)煜玻?武俊明， 陳華友

(1.江蘇大學(xué) 生命科學(xué)研究院， 鎮(zhèn)江 212000; 2.江蘇中興藥業(yè)有限公司， 鎮(zhèn)江 212000)

近年來，生物催化憑借其溫和的作用條件，獨(dú)特高效的底物選擇性等特點(diǎn)，普遍應(yīng)用于生物化工領(lǐng)域[1]。酯酶是一類水解酶，能夠在水分子的作用下將酯類裂解成酸和醇，完成酯化、酯交換等重要反應(yīng)，這些酶基于它們的特異性受體、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能而變化，廣泛用于工業(yè)酶催化。

通過微生物發(fā)酵的方法生產(chǎn)酯酶具有價(jià)格低廉、原料豐富、方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，而大多數(shù)工業(yè)生產(chǎn)使用的酯酶屬于嗜溫微生物，在高溫、高堿等惡劣的工業(yè)環(huán)境中極不穩(wěn)定乃至喪失活性[2]，這就使嗜溫酯酶的應(yīng)用受到了一定的局限。嗜熱酯酶指最適生長溫度在60 ℃以上的酶類，它融合了嗜熱酶和酯酶的基礎(chǔ)特征，在極端的自然環(huán)境下仍能保持較好的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，在生物催化領(lǐng)域越來越受到重視[3]。

1 嗜熱酯酶的來源

1.1 利用定向分子進(jìn)化技術(shù)改造常溫酯酶得到嗜熱酯酶

定向進(jìn)化是提高蛋白功能與活性的有效途徑。在確保酶穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，利用分子修飾來增強(qiáng)催化活性成為得到理想酶的新方法[4]。利用定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)嗜熱酯酶進(jìn)行改造能夠提高重要功能性非天然化合物的催化性能[5]。例如，Adesioye等[6]應(yīng)用定向進(jìn)化技術(shù)改造乙酰木聚糖酯酶的底物特異性。Liu等[7]通過定向進(jìn)化得到活性較高、底物特異性較廣泛、熱穩(wěn)定性較好的突變體擬除蟲菊酯水解酯酶。此外，利用DNA改組技術(shù)重組相關(guān)基因的片段來產(chǎn)生新的基因庫，再通過篩選也可獲得新的嗜熱酯酶。

1.2 利用基因組克隆與表達(dá)技術(shù)大量表達(dá)嗜熱酯酶

隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析獲得疑似嗜熱酯酶序列，再通過分子克隆技術(shù)擴(kuò)增并表達(dá)出該蛋白，然后對(duì)該序列進(jìn)行性質(zhì)分析，能很快得到新型嗜熱酯酶。通過該方法獲得的嗜熱酯酶與自然界中的其他酯酶不同，如來自T.Maritima的酯酶TM0033、TM0036，最適溫度為95 ℃[8]，且擁有很好的熱穩(wěn)定性。另外，來自Ureibacillusthermosphaericus的酯酶estUT1[9]在有機(jī)溶劑中表現(xiàn)出很高的穩(wěn)定性和對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性。此類耐熱酯酶因其特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及基因組易提取和克隆的特性，為工業(yè)生產(chǎn)提供了一定的參考。目前，已有多數(shù)嗜熱酯酶被分離鑒定出來(表1)。

表1 嗜熱酯酶的研究進(jìn)展

2 嗜熱酯酶的耐熱機(jī)制

嗜熱酯酶的催化功能和耐受性在高溫條件下更突出，因此嗜熱酯酶比嗜溫酯酶具有更多優(yōu)點(diǎn)，如發(fā)酵溫度高，從而減少了雜菌的污染；在高溫下無機(jī)鹽增加了離子作用，有利于生物量的提高；穩(wěn)定性好，酶解反應(yīng)速率快，易于在室溫下保存等[15]，因此在工業(yè)生產(chǎn)中有著較好的應(yīng)用潛能。

2.1 蛋白質(zhì)的氨基酸組成

嗜熱酯酶中的部分氨基酸如半胱氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸等，在高溫條件下會(huì)發(fā)生氧化水解、二硫鍵相互轉(zhuǎn)化等共價(jià)修飾作用；帶有支鏈的氨基酸如纈氨酸、蘇氨酸等在螺旋的排布中會(huì)有較多的限制，所以這些氨基酸在嗜熱酯酶中較少出現(xiàn)，約占10%；而脯氨酸、精氨酸、谷氨酸含量較高，約占32.5%，因?yàn)楦彼岬奶厥饨Y(jié)構(gòu)，在組成蛋白時(shí)比較容易折疊，但折疊后若需要解折疊則要更高的能量，因而富含脯氨酸的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性較高[16]；而精氨酸和谷氨酸相比帶同種電荷的氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)更大，而且側(cè)鏈提供的離子相互作用和疏水相互作用也有利于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的提高。

2.2 蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象

嗜溫酯酶與嗜熱酯酶的序列同源性較高，但兩者形成蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的非共價(jià)作用力不同，嗜熱酯酶更傾向于形成高穩(wěn)定性和催化活性的高級(jí)結(jié)構(gòu)。從晶體結(jié)構(gòu)的角度分析，驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)折疊形成空間結(jié)構(gòu)的主要力量是疏水作用，它為蛋白質(zhì)在水溶液中的折疊提供能量。而離子對(duì)超嗜熱蛋白的穩(wěn)定性起重要作用，它能夠穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)以及加強(qiáng)其剛性[17]。通過上述分析，來源于嗜熱微生物的蛋白通常具有耐熱的初級(jí)結(jié)構(gòu)，還有形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的疏水力，即便在體外的紛繁復(fù)雜的環(huán)境中仍能維持較好的耐熱性；因此選擇嗜熱酯酶應(yīng)用于生物催化領(lǐng)域，具有事半功倍的效果。

2.3 環(huán)境因素

大部分嗜熱酯酶本身具備熱穩(wěn)定性，另外還有少數(shù)菌體內(nèi)的嗜熱酯酶經(jīng)菌體內(nèi)環(huán)境因素增強(qiáng)其耐熱性。某些金屬離子如Ca2+、Mg2+、K+以及Zn2+等[18]也可以提高大多數(shù)酶的耐熱性。蛋白酶易失活，在應(yīng)用上有一定的局限性，而來自嗜熱菌的嗜熱蛋白酶優(yōu)點(diǎn)顯著。如Habib等[19]從溫泉中分離出兩種新的嗜熱菌(Tepidimonassediminissp.nov.andTepidimonasalkaliphilussp.nov.)，具有較高的熱穩(wěn)定性。分子伴侶與細(xì)胞內(nèi)蛋白的折疊與裝配緊密相連，它可以在生長溫度達(dá)到最高且靠近胞內(nèi)蛋白質(zhì)與酶的變性溫度時(shí)，通過重折疊保護(hù)其他蛋白質(zhì)和酶的活性，這種保護(hù)形式使嗜熱微生物能夠習(xí)慣在高溫環(huán)境下生存。

3 嗜熱酯酶的固定化

酶的固定化技術(shù)是通過物理方法或化學(xué)方法連接游離酶和相應(yīng)載體，進(jìn)而加強(qiáng)酶的穩(wěn)定性的一類技術(shù)(表2)，在工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際中發(fā)揮著重要作用[20]。固定化酶應(yīng)用于生物催化過程有較大優(yōu)勢(shì)，主要是由于固定化的生物催化劑能反復(fù)使用，穩(wěn)定性更高，后處理工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)效率大大提高；然而該技術(shù)有著不容忽視的弊端：酶在固定化過程中費(fèi)用昂貴且比較費(fèi)時(shí)，循環(huán)利用時(shí)酶活力會(huì)受到損失等。

表2 嗜熱酯酶不同固定化方式的比較

有關(guān)嗜熱酯酶的固定化報(bào)道較多，如Huttner等[26]研究了4種酯酶在嗜熱真菌中的固定化，并通過物理吸附在不同孔徑的二氧化硅顆粒上進(jìn)行了優(yōu)化。Ren等[27]利用共價(jià)連接成功地將嗜熱酯酶AFEST固定在環(huán)氧載體EC-EP上，并將固定化酶作為生物催化劑用于制備ε-己內(nèi)酯，通過系統(tǒng)研究該酶，發(fā)現(xiàn)固定化酶EC-OD-AEFST具備較好的熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性。然而，這些固定化方法通常操作過于繁瑣且成本較高，因此迫切需要新型的酶固定化方式。

近些年枯草桿菌芽孢衣殼蛋白作為良好的分子載體備受研究人員的青睞。該芽孢展示系統(tǒng)利用共價(jià)固定與芽孢吸附等作用，將外源蛋白展示在芽孢表面而不需要通過跨膜運(yùn)輸，因此利用該展示系統(tǒng)可以較容易地把大分子蛋白展示在芽孢表面(圖1)[28]。此外，枯草芽孢桿菌具備特殊的抗逆性和益生性，并且耐高溫、強(qiáng)堿等惡劣環(huán)境，回收利用方法簡(jiǎn)單，明顯節(jié)約了工業(yè)成本。該展示系統(tǒng)也是具有強(qiáng)抗逆性的酶的良好固定化載體，高溫環(huán)境的利用對(duì)耐熱性酯酶有一定的借鑒意義。

圖1 枯草桿菌芽孢表面展示酶示意圖

4 嗜熱酯酶的主要應(yīng)用

目前很多酯酶已經(jīng)商品化，廣闊的應(yīng)用前景使該類酶遍及多種行業(yè)。如Whiteley等用嗜熱酯酶催化合成生物柴油[29]，獲得期望結(jié)果。生物柴油與普通的油料相比，燃燒更充分，且無鉛，對(duì)環(huán)境影響小。研究表明，嗜熱酯酶最有價(jià)值的工業(yè)屬性表現(xiàn)如下：1)高穩(wěn)定性。能夠在室溫下分離、純化、包裝和運(yùn)輸，嗜熱酯酶作為催化劑時(shí)，其環(huán)境溫度正常大于45 ℃[30]，所以這類酶在45 ℃以上穩(wěn)定性較好。2)在有機(jī)試劑中有較好的穩(wěn)定性和活性。用有機(jī)試劑代替水作為生物催化劑有助于疏水性底物的反應(yīng)、產(chǎn)品的回收、酶熱穩(wěn)定性的提高、防止由水引起的副反應(yīng)等[27]。因此，有機(jī)溶劑有助于嗜熱酯酶活性的保持，在工業(yè)生物催化等方面發(fā)揮著重要作用。3)耐鹽性。嗜鹽微生物的酯酶尚未全面開發(fā)，它們對(duì)變性鹽的作用有很好的抗性。根據(jù)以上描述分析可知，具有多重性質(zhì)的酯酶在工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用更為廣泛，相對(duì)于其他類型的酯酶，嗜熱酯酶具備較高的熱穩(wěn)定性和底物特異性，因此在工業(yè)應(yīng)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)?；诠I(yè)生物催化劑的重要性，深入研究具有新型特征組合的酶對(duì)工業(yè)的發(fā)展具有重要作用。

5 展望

近年來，隨著定向進(jìn)化、固定化等技術(shù)的發(fā)展，研究人員發(fā)掘了大批具有應(yīng)用潛力的嗜熱酯酶，進(jìn)一步研究了其耐熱機(jī)制并獲得了顯著成效，為以后嗜熱酯酶的改造以及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了一系列的問題，諸如仍有多數(shù)嗜熱酯酶有待開發(fā)；嗜熱酯酶的穩(wěn)定性是否受其剛性和柔性的影響尚不可知；還原劑對(duì)嗜熱酯酶活性的影響因素、嗜熱酯酶的其他催化作用以及該酶的工業(yè)化應(yīng)用領(lǐng)域等，有待進(jìn)一步探索。

后續(xù)關(guān)于嗜熱酯酶的研究可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行探索：結(jié)構(gòu)學(xué)上研究DTT(DL-Dithiothreitol,二硫蘇糖醇)對(duì)嗜熱酯酶活性影響的機(jī)制，雖然有文獻(xiàn)報(bào)道嗜熱酯酶有很好的耐熱性，但很少有文獻(xiàn)報(bào)道從結(jié)構(gòu)上探索嗜熱酯酶的耐熱性機(jī)制；此外，還可以通過響應(yīng)面方法(RSM)對(duì)插入連接肽的重組酯酶的性質(zhì)進(jìn)行分析；也可以從融合蛋白結(jié)構(gòu)上分析插入連接肽后對(duì)展示的嗜熱酯酶活性影響的機(jī)制，這些將是今后研究嗜熱酯酶的熱點(diǎn)。