孟祥麗， 白金尊， 張緒帥， 李偉明， 祖 堯

(1．上海海洋大學(xué)科技部海洋生物科學(xué)國際聯(lián)合研究中心， 上海 201306；2．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201306； 3．上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心， 上海 201306)

Hox基因(Homebox gene)是編碼具有同源框的一大類轉(zhuǎn)錄因子家族，全名同源異型基因，在動物身體形態(tài)構(gòu)建過程中發(fā)揮重要作用[1]。Hox基因無論大小，其序列中均含有一段由180～183個堿基組成的保守序列，該序列編碼60～61個氨基酸所構(gòu)成的多肽區(qū)域，稱為同源結(jié)構(gòu)域( homeodomain，HD)[2]。Hox基因有在染色體上成簇排列的特點(diǎn)，并且最早Hox基因在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，而果蠅中只含有一個基因簇[3]。大多數(shù)脊椎動物在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了基因組加倍，Hox基因在這個過程中也發(fā)生了加倍。如無頜類的海七鰓鰻有兩個Hox基因簇[4]；大多數(shù)有頜類，包括人在內(nèi)的哺乳動物，經(jīng)歷了兩次全基因組加倍，具有4個Hox基因簇，小鼠中Hox基因簇分別命名為HoxA、HoxB、HoxC和HoxD[5]，總共有39個Hox基因[6-7]。大多數(shù)硬骨魚包括模式動物斑馬魚經(jīng)歷了額外的一次基因組加倍，最終形成7～8個基因簇。在斑馬魚中含有7個hox基因簇，共有48個基因[8-9]。斑馬魚hoxb7a在hoxba基因簇的中間位置，并且其在第7旁系同源組的同源基因在進(jìn)化過程中丟失，所以hoxb7a成為hox基因簇第7同源組中僅存的基因。因此，沒有因?yàn)榛蚪M加倍而產(chǎn)生冗余基因影響的hoxb7a，是探索hox單基因在hox基因簇中作用很好的候選基因。

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repects/CRISPR-associated proteins，成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列及相關(guān)的核酸內(nèi)切酶)系統(tǒng)是繼TALENs(transcription activator-like(TAL)effector nucleases)[10]、ZFN(zinc finger nuclease)之后更方便高效的基因編輯系統(tǒng)[11]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有操作簡單、成本低等優(yōu)勢，目前已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于多種模式生物中[12]。斑馬魚(Danio rerio)是一種小型熱帶魚類，體長3～4 cm，具有易飼養(yǎng)，產(chǎn)卵量大，生殖周期短，胚胎體外發(fā)育，便于觀察等優(yōu)勢，是研究基因功能的理想模式生物。

為了研究hoxb7a在hox基因簇中的作用，作者利用CRISPR/Cas9技術(shù)在斑馬魚中構(gòu)建了hoxb7a基因的突變體。通過檢測其他hox基因在hoxb7a突變體中的表達(dá)量變化，初步探究了hoxb7a在整個hox基因簇中發(fā)揮的作用，期望為hoxb7a基因功能機(jī)制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 斑馬魚的來源與飼養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)所用野生型斑馬魚均為AB品系，養(yǎng)殖水溫為28.5 ℃。本實(shí)驗(yàn)室提供設(shè)備完善的斑馬魚魚房，且提供專門為斑馬魚產(chǎn)卵的產(chǎn)卵缸。斑馬魚生活在經(jīng)過UV及曝氣處理過的循環(huán)系統(tǒng)，水溫為28.5 ℃。斑馬魚產(chǎn)卵后將魚卵收集后放于28.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對斑馬魚的所有處理均以科研為目的進(jìn)行養(yǎng)殖和使用，且按照上海海洋大學(xué)動物倫理相關(guān)規(guī)定進(jìn)行(IACUC 20171009)。

1.1.2 儀器及試劑

本實(shí)驗(yàn)所用主要儀器包括常規(guī)PCR儀(Bio-Rad公司)、熒光定量PCR儀(羅氏公司)、凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)等。主要試劑包括Taq酶(全式金公司)、體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Life Technologies)、感受態(tài)細(xì)胞(天根公司)及熒光定量檢測試劑盒(羅氏公司)等。

1.1.3 質(zhì)粒來源

實(shí)驗(yàn)所用的體外合成Cas9 mRNA質(zhì)粒由北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張博教授贈予。實(shí)驗(yàn)所用的體外合成gRNA pUC19-scaffold plasmid由北京大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究所熊敬維教授實(shí)驗(yàn)室贈予。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)敲除靶點(diǎn)及檢測引物

采用Ensembl網(wǎng)站(http://ensembl.org/Danio_rerio/Info/Index)中斑馬魚hoxb7a基因序列，通過Cas9靶點(diǎn)預(yù)測網(wǎng)站(http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx)設(shè)計(jì)hoxb7a的gRNA靶位點(diǎn)為GGCTACGGCTCGGCTTCAAC。靶位點(diǎn)經(jīng)NCBI網(wǎng)站檢測特異性后，設(shè)計(jì)檢測引物，上游引物為ATTGTATTATGCGAACGCGCTG；下游引物為TTGATGGTAGCCCCTCTGCT。

1.2.2 CRISPR/Cas9技術(shù)敲除斑馬魚hoxb7a基因

體外轉(zhuǎn)錄合成hoxb7agRNA 和Cas9 mRNA, 將Cas9 mRNA和gRNA按一定的比例配成混合液，Cas9 mRNA 300～600 pg，gRNA 80～100 pg，將混合液注射到斑馬魚一細(xì)胞期動物極中。48 hpf取胚胎進(jìn)行T7E1酶切檢測。將酶切檢測為陽性的胚胎養(yǎng)至成魚為F0。

1.2.3 獲得hoxb7a純合突變斑馬魚

將F0養(yǎng)至成魚，與野生型斑馬魚外交篩選獲得可遺傳的F0。并將可遺傳的F0外交所得的F1養(yǎng)至成魚。F1內(nèi)交篩選獲得F2純合突變體。

1.2.4 QPCR 檢測基因表達(dá)情況

收集 48 hpf的hoxb7a-/-和野生型斑馬魚各 30 尾，提取 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。每個樣品做3次技術(shù)重復(fù)，每個基因做3個生物學(xué)重復(fù)，采用表1中引物，進(jìn)行QPCR檢測。

表1 QPCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚hoxb7a的進(jìn)化地位

斑馬魚中含有7個hox基因簇，分別命名為：hoxaa、hoxab、hoxba、hoxbb、hoxca、hoxcb和hoxd(圖1-A)。斑馬魚hoxb7a基因是進(jìn)化過程中第7旁系同源組中僅存的基因。人和小鼠中有HOXA7(Hoxa7)和HOXB7(Hoxb7)，非洲爪蟾中有HoxB7A和HoxB7B。我們對斑馬魚hoxb7a基因和其他物種hoxB7基因進(jìn)行了同源性比對，構(gòu)建進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示，斑馬魚hoxb7a與輻鰭魚綱金錢魚科金錢魚和硬骨魚綱鯉科魚類鯉魚hoxb7a聚為一支，有較高的同源性，同源性分別高達(dá)96%和94%(圖1-B)。而與哺乳類的人和小鼠，兩棲類的非洲爪蟾同源性較低。

2.2 利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功編輯斑馬魚hoxb7a基因

斑馬魚hoxb7a共有2個外顯子，我們在斑馬魚hoxb7a第1個外顯子上設(shè)計(jì)Cas9敲除靶位點(diǎn)(圖2-A)，將Cas9 mRNA和hoxb7agRNA共注射入斑馬魚一細(xì)胞期動物極中，48 hpf后提取基因組，PCR擴(kuò)增出目的片段，利用T7E1酶切檢測敲除情況。結(jié)果顯示，hoxb7agRNA成功編輯靶位點(diǎn)，T7E1酶切成功(圖2-B)突變效率平均為43%。同時，我們將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，測序峰圖也顯示在靶位點(diǎn)位置出現(xiàn)亂峰，表明對hoxb7a基因敲除成功(圖2-C)。

圖1 斑馬魚hoxb7a基因的進(jìn)化地位

圖2 利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯斑馬魚hoxb7a基因

2.3 成功獲得斑馬魚hoxb7a純合突變體

我們將檢測hoxb7a敲除成功的斑馬魚胚胎養(yǎng)至成魚，進(jìn)一步篩選敲除成功的斑馬魚從而獲得可遺傳的F0，將F0外交獲得F1雜合突變體。通過對F1hoxb7a+/-進(jìn)行基因型鑒定，我們成功獲得兩種基因突變類型：hoxb7a+/-基因缺失 8 個堿基(Δ8 bp)，圖3-A和缺失23 個堿基(Δ23 bp)，圖3-B，并且兩種突變類型都出現(xiàn)了移碼突變，提前產(chǎn)生了終止密碼子。我們將hoxb7a+/-F1內(nèi)交獲得F2，通過對F2剪尾進(jìn)行基因型鑒定，成功檢測得到兩個等位基因同時突變的hoxb7a純合突變體。

*代表出現(xiàn)終止密碼子

圖3斑馬魚hoxb7a兩種突變類型

Figure 3 The two mutant fish lines of zebrafishhoxb7a

2.4 斑馬魚hoxb7a基因缺失導(dǎo)致基因簇中相鄰hox基因表達(dá)量上調(diào)

斑馬魚基因組在進(jìn)化過程中發(fā)生了加倍，而hox基因簇中第7旁系同源組基因在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了基因的丟失，最終在hox第7同源組基因中只保留了hoxb7a一個基因。本文探究hoxb7a缺失后hoxb基因簇的其他基因成員表達(dá)量是否受到影響。我們在斑馬魚胚胎發(fā)育48 hpf分別提取野生型和hoxb7a突變體RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用QPCR檢測hoxb基因簇中其他基因的表達(dá)量變化。我們首先選擇了hoxba基因簇中距離hoxb7a較遠(yuǎn)的hoxb1a和hoxb10a及hoxb7a兩側(cè)的hox基因進(jìn)行了QPCR實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示距離hoxb7a較遠(yuǎn)的hoxb1a和hoxb10a基因在hoxb7a突變體中表達(dá)量變化不明顯(P>0.05)。而在hoxb7a兩側(cè)的基因中除hoxb8a表達(dá)量出現(xiàn)了顯著性的升高外(P<0.001)，其他幾個基因表達(dá)量變化同樣不明顯(P>0.05)，圖4-A。這引起了我們的關(guān)注去進(jìn)一步檢測hoxbb基因簇中相關(guān)hox基因的表達(dá)量變化。

圖4 斑馬魚hoxb7a突變體中相關(guān)hox基因表達(dá)量變化

hoxbb基因簇是hoxb基因簇進(jìn)化中加倍后產(chǎn)生的另一基因簇，我們選取了hoxbb基因簇中的基因進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，hoxb1b(P>0.01)，hoxb8b(P>0.05)在hoxb7a突變體中表達(dá)量變化不明顯，hoxb5b和hoxb6b兩個基因表達(dá)量顯著升高(P<0.001)(圖4-B)。綜上，我們發(fā)現(xiàn)，在基因簇中距離hoxb7a較遠(yuǎn)的基因hoxb1a、hoxb1b、hoxb10a受hoxb7a影響不明顯。而在基因組上靠近hoxb7a的基因hoxb5、hoxb6、hoxb8受到了hoxb7a的調(diào)控，并且進(jìn)化過程中加倍的兩個基因中只有一個基因受到調(diào)控，分別是hoxb5b、hoxb6b、hoxb8a。

此外，我們還選擇了hoxa基因簇中的hoxa9a進(jìn)行了檢測。QPCR結(jié)果顯示，hoxa9a基因在hoxb7a突變體中表達(dá)量上調(diào)(P<0.001)，表明hoxb7a不僅作用于hoxb基因簇，和其他基因簇基因也具有一定的相互調(diào)控關(guān)系。

3 討論

Hox基因在進(jìn)化過程中的加倍，使得加倍的基因在功能上分化更加精細(xì)，旁系同源基因之間相互作用共同調(diào)控機(jī)體發(fā)育。在小鼠中，Hoxa基因簇和Hoxb基因簇共同作用使得顱面存在多樣性，Hoxb基因簇缺失可以增強(qiáng)單個Hoxa基因簇缺失導(dǎo)致的缺陷表型[13]。此外，在心臟器官發(fā)育過程中，Hoxa和Hoxb基因簇也存在相互作用。2013年Soshnikova等人報(bào)道缺失單個Hoxa或Hoxb基因簇心臟未出現(xiàn)明顯表型。但當(dāng)兩個基因簇同時缺失時，心臟環(huán)化明顯異常[14]，這體現(xiàn)了加倍的Hox基因簇之間的相互作用。同樣單個Hox基因與其旁系同源基因間也存在相互作用，例如小鼠中Hoxa1和Hoxb1共同調(diào)控心臟流出道的發(fā)育[15-16]，斑馬魚中hoxb1a和hoxb1b相互作用共同調(diào)控菱腦節(jié)的發(fā)育[17]。

斑馬魚hoxb7a在進(jìn)化過程中其縱向旁系同源基因丟失，且位置處于基因簇的中間(圖1-A)，這使得研究hoxb7a在基因簇中的作用變得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)將斑馬魚hox基因簇中比較特異的hoxb7a基因進(jìn)行了敲除，并成功篩選獲得F2純合突變體。在hoxb7a純合突變體中我們檢測了hoxb基因簇其他hox基因成員mRNA水平的變化。QPCR結(jié)果表明：hoxb7a基因突變后僅引起鄰近旁系冗余hox基因(hoxb5b、hoxb5a、hoxb6a、hoxb6b、hoxb8a、hoxb8b)中的一個基因上調(diào)，例如在hoxb7a突變體中僅hoxb5b、hoxb6b、hoxb8a基因受到影響。這暗示在旁系同源組中僅存的hoxb7a基因調(diào)控功能比較重要，而加倍后的冗余hox基因功能出現(xiàn)分化。

關(guān)于hoxb7a的突變體，目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道。對于hoxb7a的基因功能已有一些初步的研究，2015年Rochtus等人報(bào)道hoxb7a敲降后斑馬魚發(fā)育遲緩，色素衰減。當(dāng)過表達(dá)不同濃度hoxb7amRNA后，斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生不同程度的紊亂，這說明hoxb7a基因在神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮作用[18]。另外，也有文獻(xiàn)報(bào)道，hoxb7a和hoxa9a可以補(bǔ)救cdx4基因缺失導(dǎo)致的血管缺陷，這說明hoxb7a在血管發(fā)育過程中也發(fā)揮重要作用[19]。我們在hoxb7a突變體中檢測hoxa9a的表達(dá)量變化，發(fā)現(xiàn)hoxb7a缺失后，hoxa9a表達(dá)量顯著升高，這也初步顯示hoxb7a和hoxa9a基因之間存在著一定的相互調(diào)控關(guān)系。本研究成功構(gòu)建了hoxb7a缺失突變體，為更好的研究hoxb7a的功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建斑馬魚hoxb7a基因突變體，發(fā)現(xiàn)hoxb7a在hox基因簇中可以調(diào)控多個hox基因的表達(dá)，尤其對基因組相鄰位置的hox基因影響顯著。