李玉梅 楊波 劉秦川

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的人類(lèi)惡性腫瘤之一，并且近年來(lái)其發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因口腔鱗癌而死亡的人數(shù)超過(guò)400 000人，其中80%的死亡人口來(lái)自發(fā)展中國(guó)家［1］。隨著對(duì)口腔鱗癌研究的深入，目前的觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為口腔鱗癌是由致癌物引發(fā)的一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，其中癌癥相關(guān)基因的改變?cè)谶@一過(guò)程中具有重要作用。研究者普遍認(rèn)為癌癥相關(guān)的基因變化來(lái)自于遺傳信息的丟失、突變或過(guò)表達(dá)［2］。microRNAs（miRNA）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22nt的非編碼RNA，通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)［3］。許多miRNA參與了重要的生物學(xué)過(guò)程，例如細(xì)胞分化以及上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）等。目前的研究發(fā)現(xiàn)在許多腫瘤組織中，均發(fā)生了miRNA的含量改變［4］。但目前對(duì)于口腔鱗狀細(xì)胞癌與miRNA表達(dá)改變的報(bào)道較少，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些與口腔鱗癌的發(fā)生和發(fā)展存在一定聯(lián)系的miRNA，其中包括miR-34b，miR-100，miR-125b miR-137，miR-193a和miR-203等。與正?？谇火つそM織相比，這些miRNA的表達(dá)含量在口腔鱗癌中發(fā)生特異性的改變［5］。此外，多項(xiàng)研究證明miR-126的含量在結(jié)腸癌、胃癌以及惡性血液腫瘤中發(fā)生了顯著改變［6-8］。但是miR-126是否參與了口腔鱗癌細(xì)胞的生物學(xué)功能過(guò)程，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究檢測(cè)miR-126在口腔鱗癌以及正?？谇火つそM織中的表達(dá)水平差異，并改變口腔鱗癌細(xì)胞中miR-126的表達(dá)水平來(lái)觀(guān)察其在增值、遷移方面的變化，進(jìn)而探究miR-126在口腔鱗癌中可能的作用并為臨床診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

自2010-08～2017-06共收集于漢川市人民醫(yī)院口腔科確診的18例口腔鱗癌患者的鱗癌標(biāo)本及周邊非癌變口腔黏膜組織，所有收集標(biāo)本均經(jīng)病理檢查明確診斷及腫瘤細(xì)胞惡性程度判定。8例正?？谇火つ?biāo)本來(lái)自正常成年志愿者。詳細(xì)記錄納入標(biāo)本提供者的年齡、性別、吸煙史等資料。本研究經(jīng)過(guò)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有標(biāo)本提供者均簽署知情同意書(shū)。口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系（SCC-4，SCC-9和SCC-15）購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM/F12完全培養(yǎng)基、Trizol提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectatmine 3000、PIK3R1抗體（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)）；MTT細(xì)胞活力檢測(cè)試劑（Sigma公司，美國(guó)）；Matrigel基質(zhì)膠（BD公司，美國(guó)）；miR-126 agomir、miR-126 antagomir及陰性對(duì)照（negative control）（上海吉瑪制藥技術(shù)公司，美國(guó)）；Western bolt相關(guān)試劑、RIPA蛋白裂解液（上海碧云天生物技術(shù)公司）；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Promega公司，美國(guó)）。

1.3 qRT-PCR

使用Trizol法提取標(biāo)本總RNA，并用Nano-Drop2000紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度和純度（A260：A280）。將miRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，合成的cDNA產(chǎn)物直接用于PCR或保存于-20℃待用。采用SYBR GreenⅠ法進(jìn)行miR-126的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。反應(yīng)體系如下：miR-127逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2μl，SYBR Green Mix 9μl，上下游引物各1μl，加入DEPC水將反應(yīng)總體系配至20μl。PCR反應(yīng)程序如下：預(yù)變性：94℃5 min，變性：94℃30 s，退火：58℃30 s，延伸：72℃30 s，設(shè)置30個(gè)反應(yīng)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。U6為miR-126內(nèi)參。miR-126引物根據(jù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)，由上海吉瑪公司合成。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

口腔鱗癌細(xì)胞系SCC-4細(xì)胞置于恒溫CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待匯合度達(dá)80%左右加入Lipofectamine試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將口腔鱗癌細(xì)胞分為3組，分別加入miR-126 agomir、miR-126 antagomir以及negative control。后將細(xì)胞置于5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培育1～3 d以供檢測(cè)。

1.5 Western blot檢測(cè)PIK3R1蛋白表達(dá)水平

洗滌并收集SCC-4細(xì)胞，使用RIPA裂解液獲得蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量，后加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液煮沸。配制10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將蛋白樣品以20μl/孔上樣，設(shè)定70 V恒壓電泳，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印60 min，封閉1 h。后按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋一抗，加入PVDF膜4℃孵育過(guò)夜。次日TBST洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h后顯色，獲得圖像使用Image J軟件分析。

1.6 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

分別將轉(zhuǎn)染miR-126 agomir、miR-126 antagomir以及negative control的SCC-4細(xì)胞消化為懸液后接種至96孔板，每種細(xì)胞每孔接種量為2×103個(gè)，置于37℃5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，在每孔細(xì)胞中加入20μl MTT繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液棄去，每孔加入DMSO 200μl，搖床混勻約10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定A570nm光吸收值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.7 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)

收集不同轉(zhuǎn)染組的SCC-4細(xì)胞，加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使用計(jì)數(shù)板將細(xì)胞懸液吸出滴入計(jì)數(shù)板，統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)板中四大格細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，將1×103個(gè)細(xì)胞懸液加入transwell小室，并于24孔板下室加入500μl DMEM完全培養(yǎng)基；將24孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中48 h，后取出小室移除培養(yǎng)基，將小室底膜進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

根據(jù)Promega雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將包含有與相應(yīng)miRNA-126互補(bǔ)結(jié)合的靶基因PIK3R1 3'-UTR序列片段和突變的3'-UTR序列片段克隆到pGL3-Luciferase基因下游的多克隆位點(diǎn)中。正常培養(yǎng)的Hela 493T細(xì)胞，以4×105個(gè)/ml接種于6孔培養(yǎng)板，每孔體積1 ml。轉(zhuǎn)染包含PIK3R1 3'-UTR或突變的PIK3R1 3'-UTR的熒光素酶質(zhì)粒，以及miRNA-126 agomir、miRNA-126 antagomir或negative control。轉(zhuǎn)染48 h后收集293T細(xì)胞，進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間分析用單因素方差分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-126在口腔鱗癌組織和正常組織中的表達(dá)

采用qRT-PCR檢測(cè)口腔鱗癌組織及正?？谇火つそM織中miR-126的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR-126在口腔鱗癌組織中表達(dá)降低，含量為正?？谇火つそM織的0.64倍，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖1）。

2.2 不同鱗癌細(xì)胞系中miR-126表達(dá)水平

采用qRT-PCR檢測(cè)正常口腔黏膜上皮細(xì)胞、SCC-4，SCC-9和SCC-15中miR-126表達(dá)水平，結(jié)果顯示，3種口腔鱗癌細(xì)胞中miR-126表達(dá)水平均低于正?？谇火つど掀ぜ?xì)胞，其中SCC-9中表達(dá)水平最低，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05；P＜0.01）。因此使用SCC-9進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2）。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)

在口腔鱗癌細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-126 agomir、miR-126 antagomir以及negative control，采用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后miR-126表達(dá)水平，結(jié)果顯示miR-126 agomir可以顯著上調(diào)細(xì)胞中miR-126的表達(dá)水平，反之，加入miR-126 antagomir后其表達(dá)水平受到抑制，表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖1 口腔黏膜正常組織和鱗癌組織中miR-126表達(dá)水平Fig 1 miR-126 expression in normal and oral mucosa and OSCC

圖2 不同口腔鱗癌細(xì)胞系中miR-126表達(dá)水平Fig 2 miR-126 expression levels in different OSCCcell lines

圖3 不同轉(zhuǎn)染條件下miR-126的表達(dá)水平Fig 3 miR-126 expression levels under different transfection conditions

2.4 miR-126對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響

MTT法檢測(cè)不同處理組鱗癌細(xì)胞的增殖能力，顯示上調(diào)miR-126表達(dá)含量后，細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，反之，下調(diào)miR-126的表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力明顯提高，結(jié)果具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖4）。

2.5 miR-126對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響

使用transwell小室檢測(cè)不同處理組口腔鱗癌細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于對(duì)照組，上調(diào)miR-126后，細(xì)胞遷移能力受到抑制，反之，下調(diào)miR-126的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力得到提高，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（圖5）。

圖4 不同轉(zhuǎn)染條件下對(duì)鱗癌細(xì)胞增殖能力的影響Fig 4 The effect of different transfection conditions on the proliferation of OSCCcells

圖5 不同轉(zhuǎn)染條件下對(duì)鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響 （甲苯胺藍(lán)染色，×200）Fig 5 The effect of different transfection conditions on the migration ability of OSCC cells （Toluidine staining，×200）

2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-126靶基因

為檢測(cè)miR-126可能的靶基因，搜索生物信息學(xué)網(wǎng)站miRanda和Targetscan，發(fā)現(xiàn)PIK3R1的3'UTR區(qū)存在miR-126的結(jié)合位點(diǎn)，因此推測(cè)miR-126可能調(diào)節(jié)PIK3R1的表達(dá)。同時(shí)，采用Western blot檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組中PIK3R1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)miR-126后PIK3R1的表達(dá)水平上升，反之，下調(diào)miR-126后PIK3R1的表達(dá)水平上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖6）。為進(jìn)一步明確miR-126與PIK3R1存在直接結(jié)合，構(gòu)建含有PIK3R1 3'UTR結(jié)合位點(diǎn)的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體。結(jié)果顯示，在含有PIK3R1 3'UTR序列的細(xì)胞中，加入miR-126后，較之對(duì)照組其熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01），而在PIK3R1 3'UTR突變組中則無(wú)明顯改變（圖7）。

圖6 不同轉(zhuǎn)染條件下PIK3R1蛋白表達(dá)水平Fig 6 PIK3R1 protein expression under different transfection conditions

圖7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)Fig 7 Dual luciferase reporter experiment

3 討 論

MicroRNA是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。第一個(gè)miRNA是在20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)的。然而，直到21世紀(jì)初，miRNA才被認(rèn)為是具有獨(dú)特調(diào)節(jié)功能的一類(lèi)物質(zhì)。其自身通常不參與編碼合成mRNA，而是在轉(zhuǎn)錄后水平參與靶基因調(diào)控過(guò)程，其作用遍及生命體的發(fā)生、生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和死亡的各個(gè)過(guò)程。如楊倩娟等［9］發(fā)現(xiàn)miR-20可參與人炎癥牙周膜干細(xì)胞成骨分化過(guò)程。其他研究也發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在發(fā)生病理過(guò)程中其miRNAs表達(dá)也發(fā)生不同變化［10］。2009年的一項(xiàng)研究探討了miR-205的表達(dá)水平對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響［11］。一項(xiàng)針對(duì)小細(xì)胞肺癌樣本的研究發(fā)現(xiàn)，miR-324a的水平可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后生存的指標(biāo)［12］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)miRNAs與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后也有著緊密的關(guān)聯(lián)。Shin等［13］證實(shí)miR-181a在口腔鱗癌細(xì)胞中的表達(dá)量降低，而提高miR-181a的表達(dá)含量可以抑制其靶基因K-ras的表達(dá)從而抑制了鱗癌細(xì)胞的增殖能力。近年的一項(xiàng)納入了29例口腔鱗癌患者與7例健康對(duì)照者進(jìn)行分析，通過(guò)檢測(cè)鱗癌細(xì)胞和正?？谇火つぜ?xì)胞的基因譜發(fā)現(xiàn)在口腔鱗癌腫瘤組織中有12個(gè)microRNAs上調(diào)及11 microRNA下調(diào)［14］。這些異常表達(dá)的microRNA可能與細(xì)胞增殖分化、凋亡、血管形成、腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等多種功能相關(guān)。

MiR-126最初被發(fā)現(xiàn)在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，在血管新生中發(fā)揮著重要的作用［15］。最近的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)miR-126與腫瘤細(xì)胞的增殖與侵襲能力有關(guān)。如miR-126可通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲［16］。MiR-126還可靶向作用于PIK3R2介導(dǎo)的PI3K/Akt通過(guò)調(diào)節(jié)膽囊癌細(xì)胞的生物學(xué)功能［17］。然而，對(duì)于miR-126與口腔鱗癌的關(guān)系研究較少。Yang等［18］發(fā)現(xiàn)miR-126可以靶向于EGFL7來(lái)抑制口腔鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，此外，過(guò)表達(dá)miR-126可以抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）的表達(dá)。本次研究通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-126可能的作用靶基因，并采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等方法進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-126與靶基因PIK3R1存在相關(guān)關(guān)系，證明了miR-126對(duì)于口腔鱗癌細(xì)胞生物學(xué)功能調(diào)節(jié)的可能作用機(jī)制。與此同時(shí)，采用miR-126的模擬物以及抑制物進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，一系列的體外實(shí)驗(yàn)也均證實(shí)在口腔鱗癌細(xì)胞中改變miR-126的表達(dá)對(duì)于其生物學(xué)功能有著顯著的調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌細(xì)胞中，miR-126的表達(dá)水平顯著降低，同時(shí)改變miR-126的表達(dá)水平可以調(diào)節(jié)口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，此外，miR-126可作用于PIK3R1發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用；因此miR-126可能作為一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)，對(duì)于口腔鱗癌的治療提供新的思路。