張玉蓮 龔靖淋 劉一秀 李真華 周曉紅 葉果

口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）為常見的惡性腫瘤之一，盡管患者術(shù)后經(jīng)化療控制病情發(fā)展，但5年生存率仍不足50%［1-2］。因此，尋求新的治療手段成為臨床治療OSCC的新希望。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）是近年來腫瘤發(fā)生發(fā)展的研究熱點(diǎn)，EMT的發(fā)生被認(rèn)為是癌癥轉(zhuǎn)移的啟動過程，其可使上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤獲得侵襲能力［3］。研究發(fā)現(xiàn)，鈣激活中性蛋白酶2（calcium-activated neutral protease2，calpain2）過表達(dá)可通過腎細(xì)胞癌中的AKT/mTOR信號傳導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖［4］。另有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞EMT的同時(shí)伴隨Calpain1和Cal-pain2蛋白表達(dá)的上調(diào)［5］。這些說明Calpain2可能參與包括EMT在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞的多種惡性生物學(xué)行為。因此本實(shí)驗(yàn)以口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞為研究模型，F(xiàn)N誘導(dǎo)模型細(xì)胞EMT，觀察Calpain2在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）。

1.1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（Gibco公司，美國）；FN（Sigma公司，美國）；總蛋白提取試劑盒和細(xì)胞裂解液（上海碧云天公司）；Calpain2 siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒（上海吉瑪公司）；抗E-cadherin抗體（貨號3195）和抗Twist抗體（46702）（CST公司，美國）；抗Calpain2抗體（sc-373966）（Santa Cruz公司，美國）；抗GAPDH 抗體（AP0063，內(nèi)參）、羊抗小鼠IgG-HRP及羊抗兔IgGHRP（BS13278和BS12478）（南京巴傲得公司）；聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（Millipore公司，美國）。

1.1.3 儀器 20、200和1 000μl移液器（Gilson公司，法國）；CKX41倒置顯微鏡（Olympus公司，日本）；Allegra 64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機(jī)（Beckman Coulter公司，美國）；SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；DYY-7C電泳儀（GE公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞以含12% FBS及1%青鏈霉素的RPMI 1640高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；細(xì)胞放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，生長至70%匯合度進(jìn)行傳代。

1.2.2 侵襲小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力 實(shí)驗(yàn)前拿出Matrigel膠放于冰上融化。用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠至濃度為250μg/ml。吸取稀釋好的培養(yǎng)基基質(zhì)膠混合物100μl于小室中，避免打入氣泡。將培養(yǎng)板放置到培養(yǎng)箱靜置3 h。將同步化24 h的Tca8113細(xì)胞或siRNA處理過的Tca8113細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml，吸取混合均勻的細(xì)胞懸液200μl輕輕加入Transwell小室。在小室外的24孔板下室中加入800μl含趨化因子及高濃度FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。24 h后倒掉侵襲小室中的培養(yǎng)基并用PBS洗2遍，甲醇固定20 min，PBS洗2遍，放入到0.5%結(jié)晶紫水溶液中染色20 min，PBS洗2遍，用棉簽輕輕擦掉小室內(nèi)房細(xì)胞，放置5～10 min風(fēng)干。倒置顯微鏡下觀察并取6個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)，計(jì)算侵襲率。

1.2.3 蛋白印跡檢測蛋白表達(dá) 用總蛋白提取試劑RIPA細(xì)胞裂解液（使用前20 min加蛋白酶抑制劑，使其終濃度為1 mmol/L）裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心20 min，吸取上清，采用BCA試劑盒蛋白定量，計(jì)算并制備樣品。進(jìn)行蛋白印記檢測，每泳道上樣量為30 μg，SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；配制5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次15 min；然后按要求加入Calpain2抗體（1∶1 000）、Twist抗體（1∶1 000）或E-cadherin抗體（1∶1 000）等4℃孵育過夜。一抗處理后，TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶2 000），室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，Syngene Imaging System進(jìn)行成像，以Image J對蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

1.2.4 siRNA轉(zhuǎn)染沉默Calpain2表達(dá) 轉(zhuǎn)染前24 h用1 ml高糖1640全培養(yǎng)基將模型細(xì)胞接種在6孔板上，每孔4×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70% ～90%時(shí)，更換培養(yǎng)基。siRNA的轉(zhuǎn)染濃度為60 pmol/ml，提前準(zhǔn)備配制siRNA-lipo2000混合液，預(yù)先將lipo2000試劑輕輕搖勻，按需取出適量，用高糖1640培養(yǎng)基稀釋并輕輕混合，常溫放置5 min；高糖1640培養(yǎng)基稀釋siRNA，輕輕混合；將稀釋好的lipo2000與稀釋好的siRNA混合并輕輕混勻，常溫放置20 min以形成siRNA-lipo2000混合物。設(shè)立Calpain2轉(zhuǎn)染組（siRNA-Calpain2）和空載對照組（siRNA-NC），將相應(yīng)siRNA-lipo2000混合液加入含有細(xì)胞以及培養(yǎng)液的6孔板中，十字搖晃混合。將培養(yǎng)板置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中24 h后進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計(jì)量n=6。整體數(shù)據(jù)分布不符合正態(tài)分布，組內(nèi)兩樣本比較用Mann-whitney檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（雙尾）。

2 結(jié) 果

2.1 FN對Tca8113細(xì)胞Calpain2及EMT標(biāo)志物的影響

Western blot檢測Calpain2、Twist和E-cadherin蛋白表達(dá)水平；FN（15μg/ml）處理Tca8113細(xì)胞12、24、48 h發(fā)現(xiàn)，各時(shí)間點(diǎn)Calpain2、Twist和E-cadherin相對蛋白表達(dá)量，與0 h相比，Calpain和Twist蛋白表達(dá)逐漸增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；E-cadherin蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0.05或P＜0.01）（圖1）。

2.2 FN對Tca8113細(xì)胞侵襲能力的影響

侵襲小室實(shí)驗(yàn)觀察FN對Tca8113細(xì)胞侵襲能力的影響，與空白對照組（Control）相比，F(xiàn)N（15μg/ml）組細(xì)胞侵襲數(shù)增加了（116.7±5.1）%（圖2）。

圖1 FN對Tca8113細(xì)胞Calpain2、Twist和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響Fig 1 The effect of FN on the expression of Calpain2，Twist and E-cadherin proteins in Tca8113 cells

圖2 FN對Tca8113細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×100）Fig 2 The effect of FN on the invasion ability of Tca8113 cells（Crystal violet staining，×100）

2.3 Calpain2沉默對FN誘導(dǎo)的Tca8113細(xì)胞EMT標(biāo)志物的影響

siRNA轉(zhuǎn)染沉默Calpain2蛋白表達(dá)，F(xiàn)N處理各組細(xì)胞48 h。與siRNA-NC組相比，siRNA-Calpain2組蛋白表達(dá)下調(diào)（90.3±3.3）%（P＜0.01）。與siRNANC組相比，siRNA-Calpain2組由FN誘導(dǎo)的E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)及Twist蛋白表達(dá)上調(diào)被逆轉(zhuǎn)（P＜0.01）（圖3）。

2.4 Calpain2沉默對FN誘導(dǎo)的Tca8113細(xì)胞侵襲能力的影響

siRNA轉(zhuǎn)染沉默Calpain2蛋白表達(dá)，F(xiàn)N處理各組細(xì)胞48 h。與siRNA-NC組相比，siRNA-Calpain2組細(xì)胞侵襲數(shù)下降（51.3±4.5）%（P＜0.01）（圖4）。

圖3 Calpain2沉默對FN誘導(dǎo)的Tca8113細(xì)胞Twist和E-cadherin蛋白表達(dá)的影響Fig3 The effect of calpain2 silencing on FN-induced Twist and E-cadherin protein expression in Tca8113 cells

圖4 Calpain2沉默后FN對Tca8113細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×100）Fig 4 The effect of FN on the invasive ability of Tca8113 cells after Calpain2 silencing（Crystal violet staining，×100）

3 討 論

EMT在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色［6］。研究報(bào)道，口腔鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT伴隨細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)［7］。而EMT的發(fā)生機(jī)制為細(xì)胞E-Cadherin蛋白的減少或丟失以及N-鈣黏蛋白、波形蛋白（Vimentin）或FN等間質(zhì)表型蛋白表達(dá)上調(diào)［8］。另外Twist蛋白表達(dá)上調(diào)也為EMT的標(biāo)志之一，其為一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，可與E-cadherin結(jié)合并抑制后者的活性。

本研究以FN刺激Tca8113細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)模型細(xì)胞E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，Twist蛋白表達(dá)上調(diào)，同時(shí)細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)。提示FN誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞發(fā)生EMT。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FN還可誘導(dǎo)Calpain2蛋白表達(dá)的上調(diào)。為觀察Calpain2在FN誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞EMT中的作用，本研究采用siRNA轉(zhuǎn)染沉默Calpain2蛋白表達(dá)，再以FN刺激模型細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默Calpain2后，模型細(xì)胞Tca8113由FN誘導(dǎo)的E-cadherin表達(dá)下調(diào)和Twist表達(dá)上調(diào)被逆轉(zhuǎn)，F(xiàn)N刺激誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞的侵襲活動被抑制。提示，Calpain2可能參與FN誘導(dǎo)的模型細(xì)胞Tca8113發(fā)生EMT。研究報(bào)道，作為Calpain2調(diào)節(jié)亞基的Calpain4可通過Wnt/βcatenin信號通路的激活促進(jìn)人黑素瘤細(xì)胞EMT［9］。在乳腺癌中，Calpain2可通過MAPK的介導(dǎo)調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移及黏附［10］。最新研究發(fā)現(xiàn)，Calpain2可能參與調(diào)節(jié)正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A細(xì)胞EMT［11］。這些都提示Calpain2與EMT可能存在潛在的調(diào)控關(guān)系。而Calpain2參與調(diào)節(jié)口腔鱗癌細(xì)胞Tca8113為本研究首次發(fā)現(xiàn)，圍繞Calpain2或其下游信號靶點(diǎn)進(jìn)行研究可能為臨床治療口腔鱗癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

文獻(xiàn)已報(bào)道Calpain2參與了腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及凋亡的調(diào)控［9-10，12］，但其具體的調(diào)控機(jī)制還未完全明了，有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)組未來會對Calpain2下游信號靶點(diǎn)就行研究探索，為豐富Calpain2的生物學(xué)效應(yīng)做出一定的努力?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)FN能誘導(dǎo)口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞發(fā)生EMT，該作用可能與Calpain2蛋白表達(dá)上調(diào)相關(guān)。