張蕓，汪蘭，章蔚，高瓊，熊光權(quán),王靜

(1.湖北經(jīng)濟(jì)學(xué)院 旅游與酒店管理學(xué)院，武漢 430205；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工 與核農(nóng)技術(shù)研究所，武漢 430064；3.中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開發(fā)中心，北京 100045)

鯽魚(Carassiusauratus)屬鯉科，鯉亞科，鯽屬，是淡水魚類中食用價(jià)值較高的魚類，其肉嫩味美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[1]。但由于鯽魚骨刺較多，不便于食用，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值大大降低。傳統(tǒng)的鯽魚加工產(chǎn)品種類較為單一，主要包括軟罐頭、干制品等[2]，同時(shí)傳統(tǒng)的鯽魚加工技術(shù)會(huì)產(chǎn)生大量的下腳料，這些下腳料通常會(huì)被直接廢棄，從而造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[3]。水產(chǎn)調(diào)味品通常采用魚肉或水產(chǎn)品加工后的下腳料為原料，利用水產(chǎn)品自身的酶或結(jié)合微生物產(chǎn)生的酶在一定條件下發(fā)酵制成[4]。在利用微生物制作發(fā)酵魚制品中，通常使用的發(fā)酵劑有戊糖片球菌、植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、米曲霉等[5-8]。戊糖片球菌是工業(yè)肉制品發(fā)酵中常用的一種發(fā)酵菌，是一種潛在的生物防腐劑[9,10]。戊糖片球菌在耐鹽性和耐亞硝酸鹽性方面的能力都很強(qiáng)；而且戊糖片球菌能降解產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)，對(duì)致病菌的抑菌效果相對(duì)也較好[11,12]。

水產(chǎn)調(diào)味品具有鮮美的風(fēng)味和口感，具有極大的開發(fā)價(jià)值，但我國(guó)淡水水產(chǎn)品加工所占的比重還比較低，在水產(chǎn)調(diào)味品領(lǐng)域僅有魚肉醬類產(chǎn)品，品種單一。本研究以去頭、去鰓、去內(nèi)臟的鯽魚整魚為原料，先將魚肉采用風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)和復(fù)合蛋白酶(Protamex)酶解，在酶解基料中接種戊糖片球菌發(fā)酵劑，縮短發(fā)酵時(shí)間，研究戊糖片球菌在發(fā)酵鯽魚酶解產(chǎn)物過程中的作用以及理化指標(biāo)的變化規(guī)律，優(yōu)化發(fā)酵工藝，開發(fā)新型淡水魚調(diào)味品。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料

新鮮鯽魚：購(gòu)于武商量販農(nóng)科城店；戊糖片球菌凍干粉：廣東省微生物菌種保藏中心；風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶：諾維信中國(guó)生物技術(shù)有限公司；福林酚試劑、MRS培養(yǎng)基和其他化學(xué)試劑：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器及設(shè)備

PL2002電子分析天平、FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DF-101S恒溫磁力攪拌器 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；722G可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；7890A/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀 Agilent儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鯽魚酶解基料的制備

新鮮鯽魚宰殺后除去魚鱗、魚鰓和內(nèi)臟，其余部分清洗干凈，用骨泥磨粉碎，得到魚泥。將魚泥按照每包100 g進(jìn)行分裝，-18 ℃冷凍備用。實(shí)驗(yàn)前取出在流水下解凍約1～2 h。按2∶1的比例取魚泥和水置于燒杯中，攪拌均勻，放入微型磁力攪拌子，開動(dòng)磁力攪拌器，85 ℃的溫度下預(yù)處理30 min。調(diào)節(jié)溫度降至50 ℃，加入風(fēng)味蛋白酶，酶解時(shí)間240 min，加酶量(酶料比)6‰，酶解pH值調(diào)為7.0；再加入復(fù)合蛋白酶，酶解時(shí)間240 min，加酶量(酶料比)5‰，酶解pH值調(diào)至7.0。待反應(yīng)完成后，升溫至90 ℃進(jìn)行滅酶，滅酶時(shí)間30 min，得到產(chǎn)物即為鯽魚酶解基料。

1.2.2 鯽魚酶解基料發(fā)酵單因素實(shí)驗(yàn)

在其他因素不變的條件下，分別研究接種量、食鹽添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)鯽魚酶解基料發(fā)酵的影響，酶解后的鯽魚基料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)條件：戊糖片球菌發(fā)酵劑接種量6%，食鹽添加量7%，發(fā)酵溫度35 ℃，發(fā)酵時(shí)間4 d，分別研究發(fā)酵時(shí)間1，2，3，4，5 d；食鹽添加量4%、5%、6%、7%、9%；發(fā)酵溫度25，35，40 ℃；接種量0%、3%、6%、9%等對(duì)發(fā)酵后液體的總酸(以乳酸計(jì))、多肽、氨基酸態(tài)氮、I+G含量的影響。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在最佳發(fā)酵溫度(35 ℃)條件下，以總酸(以乳酸計(jì))、多肽、氨基酸態(tài)氮、I+G的含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)三因素(發(fā)酵時(shí)間、接種量、加鹽量)三水平的正交實(shí)驗(yàn)，確定戊糖片球菌發(fā)酵的最佳工藝。正交實(shí)驗(yàn)因素水平表見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 鯽魚發(fā)酵產(chǎn)物理化成分分析

鯽魚魚肉中總氮含量的測(cè)定參考李河等的蛋白質(zhì)測(cè)定方法[13]；總酸含量的測(cè)定參考鄒大維等的方法[14]； 氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定參考甲醛滴定法[15]；呈味核苷酸二鈉(I+G)的測(cè)定參考SB/T 10371-2003；多肽的測(cè)定參考魯偉等的方法[16]。

1.2.5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析方法

參考李夢(mèng)茹的方法加以修改[17]，采用PDMS/DVB涂層的固相微萃取對(duì)鯽魚基料及發(fā)酵料進(jìn)行萃取，萃取條件：添加NaCl至飽和后，在40 ℃下萃取30 min。色譜柱：DB-5MS系列彈性毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：柱初溫40 ℃，以1.5 ℃/min升至70 ℃，然后以2 ℃/min升至100 ℃，再以6 ℃/min升至230 ℃，最后以15 ℃/min升至280 ℃，保持 2 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣(He)柱流量：恒壓 12 psi；不分流；傳輸線溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍m/z 40～400。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵效果的影響見圖1。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵過程的影響Fig.1 The effect of fermentation time on the fermentation process

注：a為總酸及I+G含量；b為多肽及氨基酸態(tài)氮含量。

由圖1可知，鯽魚酶解基料接種戊糖片球菌發(fā)酵劑后總酸(以乳酸計(jì))、氨基酸態(tài)氮、I+G、多肽含量的變化均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵4 d后，發(fā)酵趨于穩(wěn)定，4 d后增長(zhǎng)不多。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵時(shí)間選擇4 d。

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響

發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵效果的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵過程的影響Fig.2 The effect of fermentation temperature on the fermentation process

注：a為總酸及I+G含量；b為多肽及氨基酸態(tài)氮含量。

由圖2可知，鯽魚酶解基料接種戊糖片球菌發(fā)酵劑后在不同的發(fā)酵溫度下，總酸(以乳酸計(jì))、I+G、氨基酸態(tài)氮含量在40 ℃時(shí)最高，但與35 ℃時(shí)差別不大，而多肽含量在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值。而通過感官分析40 ℃發(fā)酵后得到的產(chǎn)物有脂肪氧化的味道，綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵溫度選擇35 ℃。

2.3 接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響

接種量對(duì)發(fā)酵效果的影響見圖3。

圖3 接種量對(duì)發(fā)酵過程的影響Fig.3 The effect of inoculation amount on the fermentation process

注：a為總酸及I+G含量；b為多肽及氨基酸態(tài)氮含量。

由圖3可知，鯽魚酶解基料以及接種不同劑量戊糖片球菌后，總酸(以乳酸計(jì))隨著接種量的增加而增加，接種量達(dá)到6%后趨于平穩(wěn)，而氨基酸態(tài)氮和多肽含量在接種量為3%時(shí)增加，增加接種量后發(fā)酵趨于平穩(wěn)，I+G隨接種量增加不斷增加。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)接種量選擇6%。

2.4 加鹽量對(duì)發(fā)酵效果的影響

加鹽量對(duì)發(fā)酵效果的影響見圖4。

由圖4可知，鯽魚酶解基料以及接種戊糖片球菌發(fā)酵劑后在不同的加鹽量下，總酸(以乳酸計(jì))、氨基酸態(tài)氮、I+G、多肽含量均呈先上升后下降的趨勢(shì)，總酸、I+G、氨基酸態(tài)氮隨加鹽量的上升而上升，加鹽量為7%時(shí)達(dá)到最大值，而多肽含量在加鹽量為6%時(shí)達(dá)到最大值。推測(cè)可能是由于在鯽魚酶解基料中，加入適量的食鹽可以抑制雜菌的生長(zhǎng)，而戊糖片球菌可以在一定的鹽度中生長(zhǎng)，但是當(dāng)鹽濃度過大時(shí)，戊糖片球菌的生長(zhǎng)也受到抑制。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)加鹽量選擇7%。

圖4 加鹽量對(duì)發(fā)酵過程的影響Fig.4 The effect of additive amount of salt on the fermentation process

注：a為總酸及I+G含量；b為多肽及氨基酸態(tài)氮含量。

2.5 正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及分析

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 2 The results of orthogonal test

續(xù) 表

由表2可知，綜合總酸、多肽、氨基酸態(tài)氮和I+G含量的結(jié)果，3個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)戊糖片球菌發(fā)酵鯽魚酶解基料的影響大小主次順序?yàn)椋篊>A>B，即發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵劑接種量>加鹽量。發(fā)酵鯽魚蛋白的最佳工藝條件為A3B2C3，即發(fā)酵劑接種量為6%，食鹽添加量為7%，發(fā)酵溫度為35 ℃，發(fā)酵時(shí)間為5 d。測(cè)得該組戊糖片球菌發(fā)酵鯽魚酶解基料的各項(xiàng)理化指標(biāo)高于正交實(shí)驗(yàn)中的其他組合，驗(yàn)證了正交設(shè)計(jì)優(yōu)化理論的可行性，故該條件可以作為最佳發(fā)酵條件。

2.6 不同樣品中揮發(fā)性成分分析

表3 鯽魚酶解基料中的揮發(fā)性物質(zhì)Table 3 The volatile substances in crucian carp hydrolyzate

續(xù) 表

由表3可知，經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀解析，鯽魚酶解基料中風(fēng)味成分以醇、醛、碳?xì)浠衔餅橹?，醛類含量最高，?5.89%，酯類含量較少(7.03%)。腥味是影響水產(chǎn)品品質(zhì)的一個(gè)重要因素，一般認(rèn)為醛類、醇類、酮類和少量的呋喃等物質(zhì)相互協(xié)同產(chǎn)生了腥味[18]。現(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于脂肪氧化降解的醛類物質(zhì)是引起淡水魚腥味的主要物質(zhì)，如 2-己烯醛、2,6-壬二烯醛、4-庚烯醛、E,E-2,4-庚-二烯醛、2,4,7-癸三烯醛等，這些醛類物質(zhì)風(fēng)味閾值比烷類、醇類、酸類都低且都有異味[19]。但不同品種的水產(chǎn)品中腥味物質(zhì)含量會(huì)因?yàn)樯L(zhǎng)環(huán)境、加工方式等不同而有所差異[20]。在鯽魚酶解基料中，含量較高的物質(zhì)有1-辛烯-3-醇(9.39%)、壬醛(22.20%)、2-癸烯醛(4.78%)、2,4-癸二烯醛(6.72%)。許多研究認(rèn)為2-癸烯醛、2,4-癸二烯醛是魚腥味的特征物質(zhì)，1-辛烯-3-醇則表現(xiàn)出類似于蘑菇香味，是形成魚肉風(fēng)味中的重要?dú)馕段镔|(zhì)[21,22]。

表4 戊糖片球菌發(fā)酵樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)Table 4 The volatile substances in fermentation samples of Pediococcus pentosaceus

續(xù) 表

由表4可知，經(jīng)GC-MS聯(lián)用儀解析，鯽魚酶解基料經(jīng)戊糖片球菌發(fā)酵后，揮發(fā)性成分以烯類和酯類為主。酯類含量顯著增加33%，主要有棕櫚酸乙酯(奶油香、堅(jiān)果香)、月桂酸乙酯(花果香)、辛酸乙酯(白蘭地酒香)、肉豆蔻酸乙酯(鳶尾香、油脂香)等，醛類物質(zhì)只有壬醛1種，且含量?jī)H為5.62%。說(shuō)明戊糖片球菌使鯽魚酶解基料在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了明顯的香味物質(zhì)，同時(shí)使腥味物質(zhì)大大減少，這與付湘晉、黃忠白、吳建中等人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，他們都通過研究發(fā)現(xiàn)微生物發(fā)酵可以降低水產(chǎn)品中烯醛類、二烯醛等醛類物質(zhì)的含量，從而減弱腥味[23-25]。另外，本實(shí)驗(yàn)中還檢測(cè)出甲氧基苯基肟、2-正戊基呋喃、2-丙基吡啶等呋喃、吡啶等化合物，它們對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味形成也有一定的輔助作用。

3 結(jié)論

戊糖片球菌發(fā)酵鯽魚酶解基料的最佳發(fā)酵條件：戊糖片球菌發(fā)酵劑接種量為6%，加鹽量為7%，發(fā)酵溫度為35 ℃，發(fā)酵時(shí)間為5 d。與鯽魚酶解基料對(duì)比，戊糖片球菌發(fā)酵后，鯽魚基料中的氨基酸態(tài)氮含量增加25.11%，多肽含量增加33.00%，I+G含量增加18.92%，總酸含量增加9.72%。采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析，鯽魚酶解基料中的主要揮發(fā)性物質(zhì)為3-甲基-1-丁醇、己醛、1-辛烯-3-醇、2-癸烯醛、2,4-癸二烯醛等；戊糖片球菌在發(fā)酵鯽魚酶解基料過程中，能夠顯著增加酯類的含量，增香效果較好。